全自动二维液相色谱法测定人血浆中卡泊芬净

欧荣清　严汝庆　习君　蔡骅琳　刘谋泽　吴嘉敏　王峰

摘要：目的 ：建立短检验结果回报时间、高自动化的二维液相色谱（2D-LC-UV）法测定人血浆中卡泊芬净浓度并应用于临床。方法：全自动二维液相色谱法测定人血浆中卡泊芬的净血浆浓度。结果：卡泊芬净在0.30～15.22μg·mL-1浓度范围内呈现良好线性关系，r=0.999，定量限0.30μg·mL-1，方法回收率为96.34%～100.72%，提取回收率为94.89%～97.31%，日内、日间精密度RSD 均小于7%（n=5），血浆样品在处理过程中较稳定。结论 ：本方法操作简单、准确、灵敏、自动化程度高，符合生物样品测定要求，可用于卡泊芬净血浆浓度测定。

关键词：全自动二维液相色谱;卡泊芬净;治疗药物监测

[Abstract] Objective： To establish a two-dimensional liquid chromatography （2D-LC-UV） method with short test results return time and high automation for the determination of carpofungin concentration in human plasma and apply it in clinic. Methods： The net plasma concentration of carpofen in human plasma was determined by automatic two dimensional liquid chromatography. Results： The method recoveries were 96.34%-100.72%， the extraction recoveries were 94.89%-97.31%， and the quantitation limit was 0.30μg·mL-1， r=0.999. RSDS of intra-day and intra-day precision were all less than 7% （n=5）， and plasma samples were stable in the treatment process. Conclusion： The method is simple， accurate， sensitive and highly automated， which meets the requirements of biological sample determination and can be used for the determination of plasma concentration of carpofen net.

【 Key words 】 Automatic two-dimensional liquid chromatography; Carpofungin; Therapeutic drug monitoring

【中图分类号】G644.5             【文献标识码】A             【文章编号】2107-2306（2022）1--03

卡泊芬净是第一个上市的棘白菌素类抗真菌药物，通过非竞争性抑制葡聚糖合成酶，干扰真菌细胞壁内（1，3）-β-D-葡聚糖合成，导致真菌细胞壁通透性增加发挥抗真菌作用。卡泊芬净在体内受肝功能不全、低蛋白血症、多器官功能衰竭以及药物间相互作用等因素影响，个体间血药浓度差异大。为提高抗真菌感染疗效，有必要测定血浆中卡泊芬净浓度，开展治疗药物监测（TDM），实现精准用药。

1 仪器与试剂

1.1仪器

二维液相色谱（2D-LC-UV），由FLC-2420全自动二维液相色谱耦合仪（湖南德米特仪器有限公司 ）和LC-20AT高效液相色谱部件（日本岛津株式会社 ）构成;TDZ4-WS 低速台式离心机（湖南长沙平凡仪器仪表有限公司）;XW-80A 漩涡混合器（上海琪特分析仪器有限公司）;Wini-15k 高速离心机（杭州奥盛仪器有限公司）;GH-202 电子分析天平（日本 AND）;Milli-Q超纯水纯化系统（美国Millipore公司）;容声冰箱。

FLC-2420全自动二维液相色谱耦合仪通过微流控系统将色谱泵、进样器、检测器等色谱部件耦合在一起，构成第一维液相色谱系统（LC1）与第二维液相色谱系統（LC2）;LC1主要负责样品在线富集及第一维分离，LC2主要负责样品进一步分离测定，样品通过微流控系统从LC1 转移至LC2，完成分析过程;两维系统通过智能流路控制系统（TRS）连接，采用“中心切割”模式及中间柱转移目标物，见图1。

1.2试剂与药品

卡泊芬净标准品;甲醇、乙腈;磷酸、磷酸铵;纯净水为纯水仪所制（不低于GB17323执行标准）。空白血浆和患者血浆由中南大学湘雅二医院临床科室提供。

2.方法

2.1色谱条件

第一维液相色谱系统（LC1）色谱柱为Aston  SX1（氰基柱3.5*25mm，5μm），流动相为甲醇：乙腈：10mmol‧L-1磷酸铵水溶液=1：1：10 （V：V：V），调PH至4.50，流速为0.60mL‧min-1;中间色谱柱为Aston SCB（C83.0*10mm，2.8μm），辅助流动相为纯化去离子水;第二维液相色谱系统（LC2）色谱柱为Aston MSCB（C183.0*50mm，3.3μm），流动相为水（含1.0mmol‧L-1磷酸氢二铵水溶液，磷酸调pH至7.40）：水（1.0mmol‧L-1磷酸氢二铵水溶液，磷酸调pH至3.00）：甲醇：乙腈=18：34：7：41 （V：V：V：V），测定波长为225nm。测定流程：色谱耦合仪通过预设的时间程序，自动将色谱状态分为富集净化、捕获、转移和分析。富集净化：一维色谱柱对样品进行萃取和第一维分离;捕获：目标物即将通过一维色谱柱时，中间柱开始截取目标物;转移：中间柱将目标物转移至二维色谱柱;分析：二维色谱柱继续对样品分离和分析，中间柱和一维柱在LC1在线清洗（表1）。辅助流动相流速由时间程序控制，在萃取和转移时通过增加一维流路的极性，将目标物富集于色谱柱中避免流失。目标物进入二维柱后，立即启动中间柱与一维柱清洗程序，保证系统连续分析时的可靠性。

系统工作状态

一维色谱柱工作，进行样品初级分离

中间柱与一维色谱柱连通，捕获样品中目标组分。

二维色谱柱与中间柱连通，分离测定样品中目标组分;中间柱和萃取柱在线清洗

2.2 溶液配制

标准品储备液的配制：精密称取卡泊芬净标准品1.43mg，纯化去离子水溶解并定容至25mL，得到浓度为54.80μg·mL-1的卡泊芬净标准品储备液，置-20℃冰箱保存，使用前恢复至室温并涡旋振荡混匀。

质控溶液的配制：精密吸取不同量卡泊芬净标准品储备液，空白血浆定容至10mL，配制成浓度为0.61、8.65、13.39μg·mL-1的低、中、高浓度质控溶液，置于-20℃中保存备用。

标准曲线样品：精密吸取不同量卡泊芬净标准品储备液，空白血浆定容至10mL，使浓度分别为0.30、1.00、2.00、5.02、10.04、15.22μg·mL-1，置于-20℃保存备用。

2.3 血浆样品前处理

EDTA抗凝管采集全血后经3000 rpm离心5 min，取上清液400μL置1.5mL EP管内，加入1000μL乙腈，涡旋振荡1min，14500rpm离心8min，取上清液1200μL加入进样瓶，进样800μL。

3结果

3.1 二维色谱图与专属性

在“2.1”项色谱条件下，卡泊芬净保留时间约为9.71 min，血浆内源性物质及合并用药不干扰样品的测定（见图2）。

A.空白血浆（blank plasma）  B.卡泊芬净标准溶液（13.39μg·mL）  C.空白人血浆加入卡泊芬净（LLOQ）（0.30μg·mL） D. 卡泊芬净与氟康唑联合用药患者血样色谱图

3.2线性范围和定量限

将“2.2”项下标准曲线样品，按“2.3”项下方法处理，按“2.1”项下方法测定，以卡泊芬净的峰面积（Y， mau*s]）对卡泊芬净浓度（X， μg·mL）进行线性回归，得回归方程：

Y= 281.127X，r =0.999

卡泊芬净在0.30～15.22μg·mL浓度范围内与峰面积呈良好线性关系，定量下限浓度为0.30μg·mL，信噪比S/N=10，能够满足临床卡泊芬净血药浓度测定要求。

3.3定量方法

采用外标标准曲线法定量，将测得的卡泊芬净样品峰面积代入标准曲线，计算浓度。每工作批随行测定低、中、高质控溶液。

3.4.回收率与精密度

3.4.1 转移回收率与精密度

转移回收率和精密度是体现药物在2D-LC-UV中准确、稳定传递的重要指标。2D-LC-UV可对测定过程中每一步转移进行监控，其中LC2 条件模式用于考察目标物单独经过二维柱的出峰情况，LC1条件模式用于考察目标物单独经过一维柱的情况，目标物从一维柱转移至二维柱，通过中间柱进行传递。其中中间柱在一维系统的保留能力以及中间柱在二维系统的洗脱能力是转移过程的关键之一。取适量54.80μg·mL卡泊芬净标准品储备液在“2.1”项下色谱条件进行测定，进样体积10μL，得到的峰面积与其在 LC2 条件模式下得到的峰面积比较，考察目标物在2D-LC-UV中的转移回收率和精密度。设置 6 组平行样本，测得转移回收率为98.71%，RSD为1.25%。结果表明卡泊芬净在2D-LC-UV中转移回收率高且稳定。

3.4.2 方法回收率和精密度

配制卡泊芬净浓度分别为0.61、8.56、13.39 μg·mL的标准含药血浆样品各5份，按“2.3”项下处理，按“2.1”项下色谱条件测定，将测得的卡泊芬净色谱峰面积A代入随行标准曲线方程，计算各样品中卡泊芬净浓度，连续测定3批，方法回收率在96.34%～100.72%，日间、日内精密度<7%，表明方法回收率与精密度符合生物样品分析要求。

3.4.3 提取回收率

将浓度为54.80μg·mL-1卡泊芬净标准品溶液，分别用二维流动相、空白血浆用稀释10倍，按“2.3”项下处理，按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别进样5次，计算两者峰面积比值（提取回收率=空白血浆稀释样品峰面积/二维流动相稀释样品峰面积*100%），得提取回收率为94.89%～97.31%，表明本方法的提取回收率符合生物样品分析要求。

3.4.4样品在线处理能力

全自动2D-LC-UV通过在线萃取提高测定灵敏度，但一维色谱柱载样量具有上限，因此进样量过大时，会发生柱上扩散现象。本文2D-LC-UV色谱条件下卡泊芬净定量限为0.30μg·mL，为提高灵敏度，需将进样量增大至800μL，才能满足最低点信噪比S/N=10的要求。如图4所示，本系统进样量增加至800μL时，峰面积成线性变化，因此本方法设定进样量为800μL，与普通色谱系统进样量20μL比較，灵敏度可提高40倍。

3.5稳定性考察

取低、中、高浓度质控溶液，分别在室温放置24h、4℃放置24h、反复冻融 3 次以及-20℃冷冻保3d，按“2.3”项下处理，按“2.1”项下色谱条件进样测定，考察卡泊芬净稳定性，结果见表5。结果表明血浆中卡泊芬净在室温放置24小时后降解20%以上;4℃放置24h降解10%以上，反复冻融3次以及在-20℃下保存3d卡泊芬净较稳定，降解比例均小于5%。

4 讨论

质谱法检测测定人血浆中卡泊芬净浓度快速、灵敏度高，但质谱仪及同位素内标试剂价格昂贵，检测成本高，且每次测定前需清洗离子源，操作复杂，重复性稍差。

二维液相色谱法简化了样品前处理过程，分离能力强，适用于高通量检测，被广泛应用于复杂样品及血药浓度分析。本文建立的全自动二维液相色谱系统（2D-LC-UV）测定人血浆中卡泊芬净的方法，在12min内完成测定，样本前处理步骤少，操作简单，结果易重复;样品进入二维分析柱前已初步分离净化，杂质干扰小，高度自动化极大降低了人工操作误差;方法的专属性、定量限、准确度、精密度、回收率能够满足血浆中药物浓度准确定量的要求;使用外标法就能精准定量，无添加内标物等繁琐操作，批量测定临床样本的可操作性更强。

综上所述，该方法测定成本低、自动化程度高、测定快速、灵敏度及准确性好，可作为卡泊芬净TDM及其药物代谢动力学研究的有效方法。

参考文献：

[1]Nathan PWiederhold. The antifungal arsenal： alternativedrugs and future targets[J].International Journal ofAntimicrobial， 2018.51（3）： 333-339.

[2]Muilwijk E W ， Schouten J A ， Van L H J ， et al. Pharmacokinetics of caspofungin in ICU patients[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2014，69（12）：3294-3299.

[3]Hashemian SM， Farhadi T， Velayati AA.Caspofungin： a review of its characteristics， activity， and use in intensive care units [J].Expert Rev Anti Infect Ther. 2020 Dec;18（12）：1213-1220.

[4]王新茗，张仲林，袁明勇. 新型二维高效液相色谱测定人血清伏立康唑濃度方法的建立与应用[J]. 成都医学院学报，2019，14（2）：169-173.

通讯作者：王峰，男，主要从事色谱自动化及生物样本分析研究。Tel：（0731）85292099，E-mail：roitech@126.com