饲用凝结芽孢杆菌的菌种特性及作用机制

■刘 彬 粟胜兰 张雅惠 赵小丽 石 波 李新一* 乔 宇

（1.全国畜牧总站，北京 100125；2.中国农业科学院饲料研究所，北京 100081）

虽然抗生素曾经在治疗动物疾病、提高养殖效益及保障动物生产安全等方面发挥了重要的作用，但因抗生素管理不规范、使用不合理、技术水平不足等因素致使细菌耐药和药物残留等问题日益严重，对人类健康造成了严重的威胁。早在20世纪80年代，世界各国的畜牧业就开始了预防性及促生长性抗生素添加剂的减抗、限抗、禁抗之路。我国农业农村部发布第194号公告，规定“自2020年7月1日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料”，开启了我国养殖业饲料无抗的新时代。饲料行业迎来新的契机，抗生素替代品的研究与应用成为行业面临的首要问题。益生菌是一类对宿主健康有益的活的微生物，可以补充、调整或者维持畜禽肠道菌群平衡，抑制病原微生物，调节动物机体免疫功能，从而达到提高畜禽生长性能、预防动物疾病、减少环境污染、改善畜产品品质等目的。理想的益生菌需具备几个特征：①在胃肠道环境中生存（即耐酸、耐胆汁）；②黏附肠上皮细胞；③在肠道内快速生长、定植；④稳定肠道菌群区系；⑤无致病力；⑥在食品和饲料加工过程中保持活力。芽孢杆菌是一类产芽孢的革兰氏阳性菌，与其他益生菌相比具有营养要求简单、耐热、耐酸、抗干燥等特性，在家禽、猪、反刍动物、水产养殖中应用效果显著。目前畜禽养殖中研究和应用最广泛的主要有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）和短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）等。凝结芽孢杆菌除具有芽孢杆菌的特性外，能分泌乳酸，兼具乳酸菌的特性。凝结芽孢杆菌被称为“益生菌之王”，作为抗病促生长的抗生素替代品，应用在动物生产中具有不可比拟的优势。文章从凝结芽孢杆菌菌种特性出发，重点阐述凝结芽孢杆菌在畜禽养殖中的益生机制。

1 凝结芽孢杆菌的菌种特性

凝结芽孢杆菌的首次发现可以追溯到1915年，Hammer发现凝结芽孢杆菌引起大规模的罐装炼乳凝结，1932年凝结芽孢杆菌被首次分离。在发现之初凝结芽孢杆菌被称为芽孢乳酸杆菌（Lactobacillus sporogenes），具有杆菌科和乳酸菌科的共同特征，后来才更名为凝结芽孢杆菌（B.coagulans）。凝结芽孢杆菌在细菌分类上属厚壁菌门（Firmicutes），杆菌纲（Bacilli），芽孢杆菌目（Bacillales），芽孢杆菌科（Bacillaceae），芽孢杆菌属（Bacillus）。凝结芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，细胞呈杆状，两端钝圆，单个或成对，少数呈链状。芽孢端生，芽孢体呈椭圆形。菌落为白色圆形，表面突出。凝结芽孢杆菌的生理生化特征具体表现为葡萄糖发酵产酸、不产气，精氨酸发酵不产氨；凝结芽孢杆菌利用D-甘露糖、D-木糖、淀粉，不利用柠檬酸、D-甘露醇、L-阿拉伯糖；V-P测定、接触酶、氧化酶阳性；明胶液化反应、酪氨酸水解反应、氨基酸脱羧酶反应阴性；凝结芽孢杆菌不产黏性物质、不产硫化氢（H2S）、不产吲哚。

凝结芽孢杆菌是兼性厌氧菌，在不良条件下形成芽孢，具有强抗逆性和耐热性，抵抗胃肠道内的极端环境，具有益生菌特征。凝结芽孢杆菌最适生长温度为35～50℃，最适生长pH为5.5～6.5。少数耐高温凝结芽孢杆菌在pH 6.2、60～65℃也能生长。在pH 4.5、65℃的环境中也曾分离得到凝结芽孢杆菌。凝结芽孢杆菌在100℃处理10 min，存活率可达96%，能耐受饲料加工过程中的高温、高压环境。固体剂型保存3～5年后仍保持较高的存活率。Hyronimus等（2000）发现凝结芽孢杆菌能耐受0.3%的胆盐；姚勇芳等（2017）发现凝结芽孢杆菌在pH为2.0～6.0及0.2%～0.4%猪胆盐溶液环境中存活率超过100%；汪攀等（2017）发现，在池塘底泥中分离到的凝结芽孢杆菌在pH 2.5的模拟胃液中12 h存活率为71.9%，在胆盐浓度为0.3%的模拟肠液中12 h存活率为84.4%；韩明渠等（2020）从鸡肠道内容物中筛选到一株凝结芽孢杆菌，在模拟胃液中处理180 min存活率达到72.7%，在0.6%的胆盐溶液中处理6 h存活率达到54.5%。

凝结芽孢杆菌缺乏黏附肠上皮的能力，饲喂动物后4～5 d内会从肠道内完全消失，需长期服用。将凝结芽孢杆菌按芽孢计以109个/d的剂量饲喂大鼠30 d，结果发现大鼠的肠道菌群区系得到改善。

2 凝结芽孢杆菌的有益代谢物

益生菌在生长过程中会合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质（如短链脂肪酸、细菌素等），这些代谢物与益生菌的功能息息相关。凝结芽孢杆菌分泌的代谢物如表1所示。凝结芽孢杆菌最重要的代谢物是乳酸，可作为工业生产菌在以葡萄糖和木糖为碳源、50℃厌氧条件下发酵生产乳酸。其他碳源如蔗浆、高粱汁、咖啡萃取物、小麦秸秆、玉米芯、木质纤维素水解物和玉米淀粉等发酵凝结芽孢杆菌也产乳酸。

表1 凝结芽孢杆菌分泌代谢物汇总

凝结芽孢杆菌分泌多种促进营养物质消化的酶（如β-半乳糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-淀粉酶、脂肪酶、木聚糖酶和蛋白酶等）。Batra等（2002）从温泉中分离到产β-半乳糖苷酶的凝结芽孢杆菌RCS3，分泌的β-半乳糖苷酶具有良好的热稳定性、pH稳定性以及水解能力，酶在65℃、pH 6～7时活性最高，与乳糖和乳清在50℃共孵育36 h后能完全水解。凝结芽孢杆菌KM-1产嗜热的α-半乳糖苷酶，α-半乳糖苷酶是饲料中重要的酶制剂，通过断裂豆粕中棉子糖、水苏糖等的α-半乳糖苷键，消除豆粕中半乳甘露聚糖的抗营养作用。Babu等（1995）发现凝结芽孢杆菌B49在以麦麸为基质的固体发酵中产生热稳定的α-淀粉酶。Tang等（2005）发现凝结芽孢杆菌产脂肪酶。工业上利用椰子油饼等发酵凝结芽孢杆菌生产脂肪酶。凝结芽孢杆菌还能产木聚糖酶，Heck等（2005）用固体发酵凝结芽孢杆菌BL69生产无纤维素酶活性的木聚糖酶。Prihanto等（2013）和Reyes-Mendez等（2015）的研究证明凝结芽孢杆菌能产生蛋白酶。

凝结芽孢杆菌分泌细菌素，抑制多种病原菌生长。Abada等（2008）报道凝结芽孢杆菌分泌的细菌素能抑制大肠杆菌NCTC-10418、绿脓杆菌NCIB-9016、肺炎克雷伯菌NCIB-9111、枯草芽孢杆菌NCTC-6346、金黄色葡萄球菌NCTC7447和白色念珠菌CBS-562生长。Abdhula等（2015）从传统发酵的鱼制品中分离到凝结芽孢杆菌BDU3，其分泌的细菌素对食源性的蜡样芽孢杆菌MTCC 430、金黄色葡萄球菌3160、肠球菌MTCC 9728，乳杆菌MTCCQ 0093和滕黄微球菌MTCC106的生长具有抑制作用。韩明渠等（2020）发现凝结芽孢杆菌CGMCC 16244对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用。Senna等（2017）发现凝结芽孢杆菌有抗真菌作用，抑制番茄灰霉菌、苍白镰刀菌、串珠镰孢菌三种真菌的生长。佟德军等（2020）分离到一株能降解玉米赤霉烯酮的凝结芽孢杆菌。张韵等（2017）从仔猪粪便中分离获得的凝结芽孢杆菌对大肠杆菌K88、鸡肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌表现出良好的抑菌作用。Donskey等（2001）研究了凝结芽孢杆菌对大鼠肠道中抗万古霉素的肠球菌的抑菌作用，发现用107CFU/g的凝结芽孢杆菌喂养大鼠4 d，能够抑制抗万古霉素的肠球菌生长。

研究人员解析了凝结芽孢杆菌的细菌素，发现有一类是脂肽类的表面活性素，这类细菌素由两对表面活性素异构体构成，含四种分子量均在1 000 u左右的组分，以β-羟基-异-C14或反异-C15脂肪酸通过酰胺基团和内酯键连接在7个氨基酸肽链上的[Leu7]或[Val7]组成环肽。细菌素编码基因在凝结芽孢杆菌中普遍存在，钱文江等（2020）分析了33个凝结芽孢杆菌的基因组，发现每个菌株都有1～2个细菌素的基因簇。Hyronimus等（1998）发现凝结芽孢杆菌分泌一种对蛋白酶敏感、分子量在3～4 ku的抑菌物质，称为凝固素，对肠球菌、明串珠菌、酒球菌、李斯特菌和片球菌的生长有抑制作用。Riazi等（2009）发现凝结芽孢杆菌ATCC 7050分泌分子量约为37 ku的抗菌蛋白（lactosporin），该蛋白对热稳定，等电点为3.5～4.0，经蛋白酶和脂肪酶降解后失活，对藤黄微球菌有抑制作用。

3 饲用凝结芽孢杆菌的作用机制

近年来，对饲用凝结芽孢杆菌作用机制的研究主要集中在提高动物生长性能、优化动物肠道的微生物组成、增强动物免疫功能以及提高机体抗氧化能力等方面（见图1）。

图1 饲用凝结芽孢杆菌作用机制

3.1 提高动物生长性能

凝结芽孢杆菌产生的乳酸能降低肠道pH，抑制病原菌生长，促进双歧杆菌、乳酸菌等增殖并合成多种B族维生素。肠道内的低pH有利于提高胃蛋白酶活性，提高蛋白质利用率，促进钙、磷、铁等微量元素的利用和维生素D的吸收。而且，肠道内低pH环境能改变小肠绒毛高度和隐窝深度，间接提高营养物质的消化吸收率。凝结芽孢杆菌在代谢过程分泌大量消化酶，作用于饲料中的碳水化合物、脂肪和蛋白质等，释放更多易于消化的小分子，提高饲料利用率。

凝结芽孢杆菌在动物肠道增殖过程产生氨基酸、维生素等代谢物，这些物质能与肠道内的其他菌产生协同作用促进小肠的蠕动，增强机体对营养物质的吸收。凝结芽孢杆菌还通过改变菌体代谢流，提高营养物质吸收和运输相关基因的表达水平，促进营养物质吸收。Cavazzoni等（1998）证实了凝结芽孢杆菌通过产生氨基酸、维生素和分泌的淀粉酶、木聚糖酶、蛋白酶和脂肪酶来提高饲料消化率和肉鸡生长性能。

3.2 优化肠道微生物区系组成

凝结芽孢杆菌在动物肠道内发挥“生物夺氧”效应，低氧状态为厌氧有益菌（如双歧杆菌、乳酸菌等）创造了生长的有利条件，同时抑制需氧致病菌的生长，减少产气荚膜梭菌数量。凝结芽孢杆菌代谢产生的乳酸降低了肠道内的pH，酸性环境对乳酸菌等有益菌的增殖有利，对嗜碱性致病菌有颉颃作用。而且，凝结芽孢杆菌产生细菌素，抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、绿脓杆菌、白色念珠菌等有害细菌和真菌生长。Zhou等（2020）的体内试验也证实凝结芽孢杆菌能预防家禽、猪感染致病性大肠杆菌和葡萄球菌。

3.3 增强动物免疫功能

凝结芽孢杆菌能诱导炎症介质和抗炎细胞因子产生，激发免疫系统保护宿主减少炎症反应。研究发现，凝结芽孢杆菌的免疫调节功能是通过细胞因子实现的。当细胞暴露于病毒，如腺病毒和甲型、乙型流感病毒时，凝结芽孢杆菌能显著增加细胞因子白细胞介素（IL-6、IL-8)、肿瘤坏死因子（TNF-α）和干扰素（IFN-γ）的产生。凝结芽孢杆菌免疫调节作用还表现通过减少IL-8，增加IL-10的分泌，降低宿主的炎症反应。益生菌免疫调节的机制主要有两个方面：一是细菌细胞壁上组分脂多糖、鞭毛蛋白、脂磷壁酸和脂蛋白和免疫细胞上的受体识别，免疫细胞膜的Toll样受体（TLR）激活转录因子NF-κB信号通路并诱导产生炎性细胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、IL-12、IFN-γ和共刺激因子。凝结芽孢杆菌的磷壁酸是甘油磷酸酯聚合物能与TLR-2受体结合，激活上述免疫细胞的信号通路。Jensen等（2017）证明灭活的凝结芽孢杆菌也有免疫激活和抗炎功能，能激活免疫细胞并促使趋化因子和细胞因子的产生。二是益生菌分泌的活性物质能增强免疫功能。Benson等（2012）发现凝结芽孢杆菌的代谢物能促进抗原呈递细胞的成熟，由单核吞噬细胞向巨噬细胞和树突状细胞表型转变，同时导致CD14+和CD16+促炎细胞的数量减少。

3.4 提高机体抗氧化能力

凝结芽孢杆菌增加异育银鲫幼鱼血液中髓过氧化物酶和抗超氧阴离子自由基活性，降低丙二醛含量。调节肝脏中抗氧化酶和抗氧化酶的转录调节水平来缓解氧化应激Nrf2-Keap1信号分子水平。重金属（如镉和汞），通过诱导产生活性氧（ROS）引起动物氧化应激反应。凝结芽孢杆菌由于其细菌细胞壁高含量的肽聚糖和磷壁酸而具有较高的金属吸附能力。能保护宿主免受汞引起的氧化应激研究。研究用凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌和菊粉组成的合生元对镉引起的大鼠中毒的影响，结果发现宿主体内抗氧化酶活性增加，组织中的镉水平降低，镉中毒反应有所缓解。

4 凝结芽孢杆菌的安全性

研究表明，芽孢杆菌的安全性问题主要有细胞毒性、溶血、生物胺、抗生素抗性基因转移等。能引起动物中毒具有安全性隐患的芽孢杆菌多为蜡样芽孢杆菌，该菌作为益生菌使用有腹泻型疾病或呕吐型疾病发生的风险。凝结芽孢杆菌不具有上述安全性问题，也从未检测出毒性。凝结芽孢杆菌被美国食品及药物管理局（FDA）和欧洲食品安全局（EFSA）认定是安全的菌株，被列入GRAS（Generally Recognized As Safe）和QPS（Qualified Presumption of Safety）名单中。

Endres等（2009）对凝结芽孢杆菌GBI-30、6086进行了毒理学评价，包括细菌逆转突变、体外染色体畸变实验，小鼠微核实验、大鼠急性和90 d亚慢性口服毒性试验以及兔急性眼和皮肤刺激试验，研究发现这两株凝结芽孢杆菌无致突变性、致畸性或遗传毒性。Endres等（2011）对凝结芽孢杆菌GBI-30、6086还进行了一年的慢性口服毒性试验、繁殖毒性等毒理学评价，结果表明即使是在最高剂量的条件下也未发现凝结芽孢杆菌具有毒性。

Salvetti等（2016）通过全基因测序结合传统表型分析凝结芽孢杆菌GBI-30、6086的毒力因子编码基因、抗生素抗性基因和有害代谢物编码基因（生物胺合成基因），发现凝结芽孢杆菌对链霉素和卡那霉素具有抗性，但基因组分析结果表明这两个抗生素抗性基因不易转移给其他细菌，基因组也不存在毒力因子编码基因和有害代谢物编码基因。此外，没有发现可能导致基因组重排的不稳定元素。另一项研究显示凝结芽孢杆菌MTCC 5856基因表型具有稳定性，经过3年商业化生产，该菌株无突变、无细胞毒性、无肠毒素基因。菌株在（25±2）℃环境温度下放置36个月稳定。

5 未来展望

我国农业农村部2004年第372号公告批准天津市新星兽药厂申请的饲用凝结芽孢杆菌TQ33作为饲料添加剂使用，并将凝结芽孢杆菌列入2008年公布的《饲料添加剂品种目录》中。凝结芽孢杆菌已广泛用于猪、鸡、鸭和鱼等养殖动物中，在动物日粮中添加凝结芽孢杆菌，具有显著的防病抗病、促生长的功效。凝结芽孢杆菌具有优良的益生特性，作为替抗类饲料添加剂有着广阔的应用前景。

目前，饲用凝结芽孢杆菌的应用体系尚不完善，存在着一些亟待解决的问题。主要表现为：凝结芽孢杆菌对动物促生长和抗病的作用机制还不完全明确，饲用凝结芽孢杆菌的应用技术尚不完善，凝结芽孢杆菌的基础研究、应用研究和技术推广等工作有待进一步开展；市场上的凝结芽孢杆菌产品存在着种类少、其他芽孢杆菌冒用现象，产品标准制定工作滞后，生产和使用缺乏统一的规范，迫切需要科研工作者、凝结芽孢杆菌的生产者和使用者以及行业管理部门的共同努力，健全凝结芽孢杆菌的市场应用体系，为实现无抗养殖、推动畜牧业可持续发展贡献力量。