白细胞介素-6基因敲除对创伤失血性休克小鼠肺组织Syndecan-1的影响及机制

范颖楠,冯筑生,于超平,谢建刚,王倩梅,刘善收,尹 文

空军军医大学西京医院急诊科，西安 710032

近年来，对于创伤失血性休克(traumatic hemorrhagic shock,THS)的病理生理学机制认识持续深入，相关的诊治指南继续更新发展。在2019版的《严重创伤出血和凝血病出血欧洲指南(第五版)》[1]中，系统性内皮病(systemic endotheliopathy,SE)作为创伤性凝血病(traumatic coagulopathy,TC)发生发展中的一个阶段被正式提出。SE主要相关因素包括交感肾上腺素激活、炎症、多糖蛋白复合物脱落、血小板激活与失活、内源性肝素化、凝血因子活性降低、纤溶功能异常等[2-3]。

多配体蛋白聚糖家族(Syndecans)是一类广泛存在于内皮和上皮细胞表面的跨膜糖蛋白，已知的四个Syndecan蛋白具有相似的结构，大致都分为胞外区、跨膜区和胞内区[4-5]。Syndecan-1(SDC1)是该家族中的主要成员，当前对于SDC1的研究最为广泛和深入，最近研究[6-8]显示肺血管内皮损伤在THS后急性肺损伤(acute lung injury,ALI)发病过程中扮演重要角色，而SDC1是血管内皮表面多糖蛋白的核心成分。

白细胞介素-6(IL-6)是创伤/休克后主要的炎症指标之一，而脱落的SDC1被认为是创伤/休克严重程度和预后判断的重要指标。多项创伤/休克相关研究[9-11]都显示创伤或休克后组织和血清中的IL-6与SDC1存在一定的相关性，但其具体的作用机制尚不清楚，而炎症和多糖蛋白复合物脱落是SE研究领域重要的构成部分，本研究拟探索IL-6基因敲除(knockout,KO)对THS小鼠肺组织SDC1的影响及机制。

材料与方法

1材料

1.1主要试剂与仪器 小鼠SDC1抗体、小鼠基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP9)抗体(美国Novus Biologicals公司)，小鼠磷酸化蛋白激酶B(phospho-AKT,p-AKT)抗体、小鼠AKT抗体、二抗(美国Cell Signaling Technology公司)，小鼠β-actin抗体、小鼠磷酸化核因子-κB(phospho- nuclear factor kappa-B,p-NF-κB)抗体、小鼠NF-κB抗体、CY3试剂、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)试剂、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗原修复液、自发荧光淬灭剂、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、抗荧光淬灭封片剂(武汉赛维尔生物科技有限公司)，正置光学显微镜、成像系统(日本尼康公司)，电泳仪(美国Bio-Rad公司)，TRIzol试剂(美国Therrno Fisher公司)，mRNA反转录试剂盒(美国TaKaRa 公司)，SYBR@Green荧光定量试剂(上海生工生物工程股份有限公司)，实时定量PCR 引物(广州锐博生物技术有限公司)，实时定量PCR 仪(美国Agilent公司)。

1.2实验动物 IL-6 KO小鼠由空军军医大学免疫学教研室惠赠，无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级C57BL/6购自空军军医大学实验动物中心，IL-6 KO小鼠与C57BL/6小鼠回交后，经小鼠基因鉴定(PCR扩增法)后最终获得野生型(wild type,WT)和IL-6 KO小鼠，饲养条件为光照模拟12h/12h昼夜循环，室温(24±2)℃，相对湿度40%～80%，自由摄食和饮水，本实验已由空军军医大学伦理委员会批准(20190906)。

2方法

2.1实验分组 取8～12周雄性同窝野生型和IL-6 KO小鼠，体重23～28g，随机分为正常组与THS组：野生型组(WT组)、基因敲除组(KO组)、野生型创伤失血性休克组(WT THS组)和基因敲除创伤失血性休克组(KO THS组)，各6只。

2.2THS模型制备 取1%戊巴比妥纳注射液对小鼠进行腹腔注射 (50mg/kg) ，待小鼠麻醉后将其四肢进行固定，使用止血钳横向钳夹小鼠左侧股骨干中段，致其股骨干骨折，当骨折远端有明显的离断感时，提示骨折制备成功。之后再使用1mL注射器针头紧贴小鼠剑突下边缘，针头以30°的角度斜向前略偏右插入心脏。当观察到注射器前段有血液流入时，固定注射器位置，缓慢回抽注射器，抽血量按照小鼠总血量的30%进行计算[抽血量(mL)=30%×7.7%×体重(g)][12-13]，整个抽血过程在1min之内完成。模型建立2h后，采用颈椎脱臼法处死小鼠进行后续实验操作。

2.3HE染色观察小鼠肺组织病理变化 (1)取右肺组织置于4%多聚甲醛中固定24h；(2)乙醇脱水；(3)制备石蜡切片；(4)石蜡切片脱蜡至水；(5)苏木素染色；(6)伊红染色；(7)脱水封片；(8)显微镜镜检，图像采集，根据病变严重程度进行半定量分析。

2.4免疫荧光观察小鼠肺组织SDC1变化 (1)石蜡切片脱蜡至水；(2)抗原修复；(3)组化笔在组织周围画圈；(4)血清封闭；(5)加入一抗(SDC1)；(6)加入辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔二抗；(7)加FITC试剂；(8)微波处理；(9)加CY3试剂；(10)自发荧光淬灭；(11)DAPI复染细胞核；(12)封片；(13)镜检拍照，使用Image J软件进行荧光强度分析。

2.5定量实时荧光聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测小鼠肺组织mRNA相对表达量变化 取左上肺组织，使用TRIzol提总RNA，定量后取1μg反转录成cDNA，之后进行qRT-PCR检测。使用10μL扩增体系，SYBR@Green Master Mix(2×)5μL，上下游引物各0.5μL，ddH20 4μL。扩增程序设置如下：(1)预变性95℃ 10min；(2)变性95℃ 15s；(3)退火/延伸55℃ 1min，共40个循环；(4)融解曲线阶段采用仪器默认设置。以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参，进行目的基因归一化处理获得相对表达量。各引物序列如下：(1)β-actin上游引物：5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′,下游引物：5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′;(2)AKT上游引物：5′-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3′,下游引物：5′-TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3′;(3)NF-κB上游引物：5′-TGCGATTCCGCTATAAATGCG-3′,下游引物：5′-ACAAGTTCATGTGGATGAGGC-3′;(4)MMP9上游引物：5′-GCAGAGGCATACTTGTACCG-3′,下游引物：5′-TGATGTTATGATGGTCCCACTTG-3′；(5)SDC1上游引物：5′-AGCAACACCGAGACTGCTTTT-3′,下游引物：5′-GTGCGGATGAGATGTGACAG-3′。

2.6Western blotting检测小鼠肺组织蛋白相对表达量变化 取左下肺组织，使用RIPA裂解液提总蛋白，蛋白浓度测定和加热变性后进行上样、电泳、转膜、孵育抗体[一抗(SDC1为1∶500，MMP9、p-AKT、p-NF-κB和NF-κB为1∶1000，AKT为1∶2000，β-actin为1∶5000)孵育置于4℃冰箱摇床过夜，HRP标记的二抗(1∶5000)室温震荡孵育1h、高效化学发光法(ECL)显影。

3统计学分析

结 果

1HE染色观察小鼠肺组织病理变化

WT组与KO组肺泡大小形态均匀，结构清晰，肺泡腔内无白细胞浸润和出血，两组肺组织病理损伤评分[(0.3±0.5)分vs.(0.5±0.5)分]差异无统计学意义(P>0.05)。WT THS组明显可见较多肺泡壁增厚和肺泡腔狭窄，伴有较多淋巴细胞与中性粒细胞浸润。KO THS组局部可见部分肺泡壁增厚，肺泡腔狭窄，淋巴细胞与中性粒细胞浸润，但病变程度较WT THS组减轻[(2.3±0.8)分vs.(3.7±0.5)分]，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

2免疫荧光观察小鼠肺组织SDC1表达变化

WT组与KO组SDC1主要沿肺血管内皮和肺泡上皮分布，SDC1表达比较丰富，两组肺组织SDC1荧光强度[(148.2±3.6)AUvs.(147.8±3.5)AU]差异无统计学意义(P>0.05)。WT THS组大部分肺血管内皮和肺泡上皮SDC1表达显著下降。KO THS组肺血管内皮和肺泡上皮SDC1荧光强度与WT THS组相比较高[(137.2±3.7)AUvs.(129.8±2.6)AU]，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

3qRT-PCR检测肺组织mRNA相对表达量变化

WT组与KO组的肺组织AKT、NF-κB、MMP9和SDC1的mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。KO THS组AKT、NF-κB和MMP9的mRNA相对表达量低于WT THS组，差异有统计学意义(P<0.05)。WT THS组与KO THS组SDC1的mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

4Western blotting检测肺组织蛋白相对表达量变化

WT组与KO组的肺组织p-AKT、p-NF-κB、MMP9和SDC1的蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。KO THS组p-AKT、p-NF-κB和MMP9的蛋白相对表达量低于WT THS组，差异有统计学意义(P<0.05)。KO THS组SDC1的蛋白相对表达量高于WT THS组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

WT：野生型；KO：基因敲除；THS：创伤失血性休克

WT：野生型；KO：基因敲除；THS：创伤失血性休克

AKT：蛋白激酶B；NF-κB：核因子-κB；MMP9：基质金属蛋白酶-9；SDC1：Syndecan-1；WT：野生型；KO：基因敲除；THS：创伤失血性休克;ns：差异无统计学意义;ns：P>0.05，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.0001

p-AKT：磷酸化蛋白激酶B；AKT：蛋白激酶B；p-NF-κB：磷酸化核因子-κB；NF-κB：核因子-κB；MMP9：基质金属蛋白酶-9；β-actin：β-肌动蛋白；SDC1：Syndecan-1；WT：野生型；KO：基因敲除；THS：创伤失血性休克；ns：差异无统计学意义，KD：千道尔顿；ns：P>0.05，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.0001

讨 论

严重创伤失血后会引发SE，持续发展则会进展成为TC，TC是指多因素参与的系统性凝血功能障碍，凝血功能检测可表现为高凝、低凝和纤溶亢进等不同状态，约1/3非控制性出血的创伤患者在入院时会并发凝血病，其多器官衰竭发生率和病死率明显增高，而阻断SE向TC进一步发展成为创伤领域最新研究的热点[14-16]。

肺是THS较早和较易累及的器官之一，相关研究[12]显示，失血性休克小鼠的失血量达到30%并持续2h就会造成小鼠肺组织的明显损伤，在此条件下小鼠的病死率约为10%，笔者团队研究也发现，随着失血量升高和创伤因素加入，THS小鼠的病死率会显著上升，而采用30%失血量并持续2h建立THS小鼠模型既有利于观察小鼠的肺组织损伤情况，也有利于控制THS小鼠的总体病死率完成后续实验操作。本研究显示THS小鼠模型建立后，HE染色肺组织可见肺泡壁增厚和肺泡腔狭窄，伴有淋巴细胞与中性粒细胞浸润，KO THS组肺泡壁增厚，肺泡腔狭窄，淋巴细胞与中性粒细胞浸润的病变程度比WT THS组明显减轻，提示IL-6 KO有助于缓解小鼠THS后的ALI。

既往研究[17-19]显示SDC1在ALI中发挥重要作用并可以作为ALI的损伤标志物，SDC1胞内区序列高度保守，人、大鼠和小鼠等种属此段序列都相同，胞外区连接糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)侧链结构，包括3条硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)侧链和2条硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)侧链[20-21]。通过限制蛋白和可溶性物质通过细胞连接缝隙，调节内皮表面白细胞和血小板与细胞黏附分子的相互作用，依托HS侧链调节局部细胞表面的凝血功能，SDC1对于维持血管的完整性和渗透性方面具有重要意义[22- 23]。本研究显示THS小鼠模型建立后，肺血管内皮和肺泡上皮SDC1表达明显下降，KO THS组肺血管内皮和肺泡上皮SDC1表达比WT THS组较高，各组免疫荧光显示肺组织SDC1表达与HE染色显示肺组织损伤严重程度呈负相关，提示SDC1可以作为小鼠THS后ALI的损伤标志物，这与既往研究保持一致。

有研究[24-25]提示在ALI过程中，IL-6可以通过AKT/NF-κB信号通路对MMP产生影响，本研究中qRT-PCR结果显示THS所引起的ALI会导致AKT、NF-κB和MMP9的mRNA相对表达量上升，而KO THS组与WT THS组相比，AKT、NF-κB和MMP9的mRNA相对表达量较低，表明IL-6 KO可以下调AKT、NF-κB和MMP9的mRNA表达；本研究中Western blotting检测结果显示THS所引起的ALI会导致p-AKT、p-NF-κB和MMP9的蛋白相对表达量上升，而KO THS组与WT THS组相比p-AKT、p-NF-κB和MMP9的蛋白相对表达量较低，表明IL-6 KO可以下调AKT和NF-κB的蛋白磷酸化和下调MMP9的蛋白表达。

在SDC1靠近跨膜区结构域有一个蛋白水解酶作用的部位，用于从细胞表面释放SDC1分子的胞外区，已知有多种MMP都可以作用此位点[26- 27]。本研究Western blotting检测结果显示THS所引起的ALI会导致SDC1蛋白相对表达量下降，KO THS组与WT THS组相比SDC1蛋白相对表达量较高，与免疫荧光显示SDC1表达情况一致，而qRT-PCR检测则显示THS所引起的ALI会导致SDC1的mRNA相对表达量上升，KO THS组与WT THS组SDC1的mRNA相对表达量差异无统计学意义，表明IL-6 KO通过下调MMP9，可以在蛋白水平减少其对于SDC1的切割，从而减轻SDC1蛋白的脱落，而对于SDC1的mRNA水平则无明显影响。

综上所述，在小鼠THS模型中，IL-6 KO可抑制AKT/NF-κB信号通路激活，下调MMP9，减少SDC1蛋白的脱落，进而减轻ALI损伤程度，而炎症和多糖蛋白复合物脱落在SE和TC发生发展过程中的彼此作用和相互影响值得进一步探索和发现。

作者贡献声明：范颖楠：研究设计、数据收集整理、论文撰写；冯筑生：数据统计分析、论文撰写；于超平、谢建刚：数据收集整理；王倩梅：论文修改；刘善收：经费支持；尹文：论文审定、经费支持