升角丸水提液对痤疮丙酸杆菌体外抑菌作用的实验研究

何俊辉 伏雨思 蒲文华 刘湘渝 肖锐华

摘要：目的 研究升角丸水提液对痤疮丙酸杆菌（ Propionibacterium acnes，P. acnes）的体外抑菌作用。方法 采用肉汤稀释法测算升角丸水提液对痤疮丙酸杆菌的最低抑菌浓度 （MIC），实验组升角丸水提液，阳性对照组乳糖酸红霉素溶液，阴性对照组生理盐水。结果 实验组 ，在实1-实2血平板上血平板均未见菌落，自实3血平板起可见菌落生成，故其MIC为201mg/ml;阳性对照组 MIC结果，在阳1-阳3血平板均未见菌落，自阳4血平板起可见典型菌落，故其 MIC为12.6μg/ml;阴性对照组 MIC 结果，在阴1血平板即有典型菌落生成。结论 应用升角丸水提液对痤疮丙酸杆菌的体外抑菌作用显著，值得临床研究推广。

关键词：升角丸水提液;痤疮丙酸杆菌;痤疮

痤疮是一种常见的慢性炎症性皮肤病，多好发于面颊部、额部以及下颌部，临床表现为粉刺、结节、囊肿、丘疹、脓疱以及瘢痕等，并多见于青少年，其发病率高达 70%～87%（俗称青春痘）[1]。升角丸是由黑龙江中医药大学依据古方犀角升麻丸配伍生产，医宗金鉴有言：“宜常服犀角升麻丸，并治一切粉刺、酒刺等证”，现升麻丸已用于痤疮临床治疗中，并取得了较好疗效，本文利用痤疮丙酸杆菌的体外抑菌试验进行观察与分析，探究升角丸水提液对痤疮丙酸杆菌的抑制作用，并为临床运用提供实验依据。

1 材料与方法

1. 1 实验仪器与试剂 实验菌株：痤疮丙酸杆菌标准株 ;受试药液：升角丸水提液、乳糖酸红霉素、灭菌生理盐水。将升角丸水提液作为实验组 ， 并以乳糖酸红霉素溶液作为阳性对照组 ， 以生理盐水作为阴性对照组。

1. 2 升角丸水提液的制备 称取 20 g 升角丸（药物组成：水牛角、升麻、羌活、防风、白附子、白芷、生地黄、川芎、红花、黄芩、生甘草、玄参等），加入 250 mL 超纯水，浸泡 25 min 后，超声振荡，75℃提取 1 h，过滤;在滤渣中加入 250 mL超纯水，再于相同的条件下振荡提取 1 h，过滤;合并滤液，离心 20 min（255

000 r·min-1），取上清液浓缩至 20 mL（相当于原药物 1 g·mL-1），置于 4℃冰箱中保存，并在 12 h 内使用完毕。

1. 3 实验方法

1.3.1液体培养基的制备：选用改良GAM 肉汤粉 60 mg 以及 1000 ml 蒸馏水于錐形瓶内， 加热溶解灭菌， 降温至50 ℃后再加入无菌脱纤维羊血 50 ml，摇匀，封口，制成液体培养基。

1.3.2痤疮丙酸杆菌标准株菌悬液的制备：将痤疮丙酸杆菌菌种接种于血琼脂平板， 放入厌氧培养箱，再放入恒温细菌培养箱，37°C厌氧培养48h， 取后再将细菌培养物制作成细菌涂片 ， 予以革兰染色法 ， 并在镜下观察细菌的基本形态 ，一般为呈 X状、Y状、或栅栏状，无荚膜，无鞭毛的革兰阳性杆菌 ，即为痤疮丙酸杆菌。再用一次性接种环挑取血平板上菌落 ， 同时转种于两个血琼脂平板上 ， 将其中一个血平板置于厌氧培养箱，再放入恒温细菌培养箱， 37°C厌氧培养48h标记为 1 号 ， 培养后可见典型菌落 ， 另外一直接放置于恒温细菌培养箱培养37°C培养 48 h 标记为 2 号 ， 培养后未见菌落产生。挑取1号血琼脂平板上的典型菌落，以蒸馏水稀释，用麦氏比浊计调整为0.5个麦氏浊度单位（MCF），其细菌数约1.5* 108cfu/ml，备用 。

1.3.3抑菌实验：实验组：取6支实验灭菌试管，编号为实1-实6，分别加入不同浓度的升角丸水提液1ml;阳性对照组：取6支实验灭菌试管，编号为阳1-阳6，分别加入不同浓度的乳糖酸红霉素溶液1ml;阴性对照组：取1支灭菌试管，编号为阴1 ，加入生理盐水1ml，待所有试管灭菌后 ， 再分别于每支试管中加入液体培养基 1 ml，采用移液枪，分别吸取新鲜配置的痤疮丙酸杆菌标准株菌悬液100ul分别加入实验组、阳性对照组各组的1-6试管以及阴性对照组阴1试管中，均匀振荡，再将试管置于37°C恒温厌氧培养箱培养 48 h， 各组试管培养结束后，取13个血平板，进行编号方法同试管，再采用平板浇筑法，分别吸取各组试管内混悬液lml接种于相同编号的血琼脂平板上，放置于37°C 恒温厌氧培养箱培养48h，观察实验结果。实验重复三次，分别记录结果。

1. 4 观察指标 观察各组受试液对痤疮丙酸杆菌的抑菌效果。若血平板未见菌落生成 ， 则表明该浓度的药液能够抑制细菌生长;若平板上可见菌落生成， 则表明该浓度的药液不能抑制细菌生长，能够抑制细菌生长的最低药物浓度即为该药物MIC。

2 结果

2.1实验组MIC结果 实验组实1-实2血平板上均未见菌落 ， 自实3血平板起可见菌落生成 ， 故其 MIC 为 201mg/ml。结果见表1。

2.2 阳性对照组MIC结果 阳性对照组阳1-阳3血平板上均未见菌落 ， 自阳4血平板起可见菌落生成 ， 故其 MIC 为 12.6mg/ml。结果见表2。

2. 3 阴性对照组 MIC 结果 阴性对照组在阴1血平板即有典型菌落生成。

3 讨论

中医认为痤疮是内热偏盛，又外受风邪或脾气不足，湿浊化热所致，《素问生气通天论》曰 ：“膏粱之人，内脏滞热。痤......皆肺气内郁所为”“汗出见湿，乃生痤痴 ”具体可分为肺经风热、肺经血热、胃肠湿热、毒热蕴结、血瘀痰凝、肾阴不足、心火上炎、冲任失调等， 中医常用清肺胃湿热、凉血解毒的方药治疗[2]。现代青年不良饮食起居习惯也是导致痤疮出现的原因，常食用辛辣油腻食物易生痤疮，经常饮酒抽烟，常坐在电脑手机前也比较易患痤疮。痤疮和皮肤的性质也有一定的关系，中性皮肤和偏油性的皮肤患痤疮的较多。女性化妆品不当使用，也易患上痤疮。

痤疮丙酸杆菌是一种杆棒状或略弯曲、无荚膜，无鞭毛、革兰氏染色阳性的厌氧菌，其主要寄居于皮肤、皮肤腺、肠道、生殖泌尿道，是一种机会性病原体，痤疮丙酸杆菌（P.acne）局部异常繁殖是痤疮四大经典发病机制之一[3]。近年来研究发现，P.acne可通过多个途径影响到痤疮的发病。活的P.acne可通过以下3个方面影响痤疮的发病：①诱导炎症的形成，P.acne一方面可通过激活Toll样受体（TLR）-2/4、上调抗菌肽（AMPs）表达、诱导蛋白酶激活受体（PAR）和MMPs表达以及促进角质形成细胞、巨噬细胞、皮脂腺分泌炎症因子等途径激活天然免疫，另一方面通过诱导CD4+T细胞活化和产生高滴度的抗P.acne激活细胞和体液免疫，共同促进炎症的形成;②激活皮脂腺功能，P.acne可以直接作用于皮脂腺细胞，促进皮脂分泌增加及胰岛素生长因子及其受体的表达，激活皮脂腺功能;③促进毛囊口角化，P.acne可通过诱导丝聚蛋白、角蛋白1、角蛋白10和角蛋白17等表达，增强角质形成细胞角化，促进毛囊口角化。因此，P.acne在痤疮发病中作用不仅重要而且涉及到痤疮发病的多个环节，所以有效杀灭抑制 P.acne 是控制痤疮发病的重要手段之一。

升角丸是由水牛角、升麻、羌活、防风、附子、白芷、生地黄、川芎、红花、黄苓、玄参、生甘草等药物，蜜调为丸。方中重用水牛角，与升麻共为君药，同起清热凉血解毒之功效[4]。生地黄、玄参清热养阴、黄苓凉血解毒，白附子解毒排脓，四药共为臣药，能加强君药清热凉血解毒之功。羌活、防风解表祛风胜湿，白芷消肿排脓，红花、川芎行气活血祛瘀，五药共为佐药。甘草既能清热解毒、又能调和药性，是为佐使药。綜观全方，苦寒辛甘合用，于大量苦寒药中配伍少许辛甘药，既防止苦寒伤中，又不失清热凉血之功。诸药合用，共奏清热解毒、凉血祛风、散瘀之功效。因此，升麻丸对痤疮丙酸杆菌的体外抑菌作用非常显著 ， 值得临床研究推广。

参考文献：

[1]纪青，张佳宾，蔡宏为，等.中西医结合治疗680例寻常性痤疮的治疗体会[J].内蒙古医学院学报，2010，32（04）：402-404.

[2]吴美玲，朱延涛.中医药治疗痤疮研究进展[J].新中医，2020，52（12）：13-15.

[3]许德田，刘玮.痤疮丙酸杆菌和痤疮：进展与悖论[J].临床皮肤科杂志，2016，45（03）：234-237.

[4]綦雪巍. 升角丸治疗寻常型痤疮（肺经血热证）的临床观察[D].黑龙江中医药大学，2012.

项目基金：长沙医学院大学生创新创业训练计划项目：长医教[2021]47号-109

第一作者：何俊辉（2000.6-），男，本科，针灸推拿学

*通讯作者：肖锐华（1994.5-），女，本科，助教、针灸推拿学专业方向