多年生黑麦草种质资源物候期和形态性状

张晨晨，曾令霜，张 敬，徐 彬

（南京农业大学草业学院, 江苏 南京 210095）

多年生黑麦草(Lolium perenne)为冷季型禾草，广泛分布于全球温带地区[1]，是一种重要的经济草种[2]。作为草坪草，多年生黑麦草具有分蘖能力强、耐贫瘠、耐践踏和耐修剪特性，是秋冬季交播的草坪先锋草种[3]，被广泛用于家庭草坪、高尔夫球场、城市景观和其他运动场地[4-5]。作为牧草，多年生黑麦草具有较高的产量和营养价值[6]，是我国南方中高海拔丘陵地区建植多年生栽培草地的重要草种[7]。近年来，科研单位和企业不断从国外引入多年生黑麦草新品种和种质资源，但多年生黑麦草种质资源的性状描述不清，亲缘关系和种群结构等信息较为模糊，制约了多年生黑麦草育种工作的开展。

种质资源是植物种质创新及利用的物质基础与前提，种质资源的丰富程度直接影响品种改良和新品种培育[8]。对多年生黑麦草种质物候期和形态性状的评价和归类，是多年生黑麦草种质筛选和鉴定的基础，也是分析其种质遗传多样性及群体结构的重要手段。尽管鉴定多年生黑麦草种质遗传多样性的分子标记技术已较为成熟[9-11]，但是基于物候期和形态性状的测定和比较仍然是种质资源利用研究的重要方法和依据[12]，对筛选适应我国环境特点的多年生黑麦草种质及新品种培育具有十分重要的意义。

本试验以南京地区种植的89 份国外引进及10 份自主选育的多年生黑麦草种质为材料，连续3 年观察其物候期及形态性状特征，通过主成分分析及其构建的函数评价模型得分进行综合评价[13-14]，并采用聚类分析方法对种质进行分类比较[15]，以期探究多年生黑麦草种质间的形态性状差异，为多年生黑麦草遗传资源的鉴定、筛选优良种质资源和新品种选育提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料共计99 份多年生黑麦草种质，其中89 份为国外引进的多年生黑麦草种质(https://www.ars-grin.gov)，其余10 份为自主选育材料(表1)。

表1 供试多年生黑麦草种质材料来源Table 1 Source of perennial ryegrass germplasm used in this study

续表1Table 1 (Continued)

1.2 试验方法

大田试验分别于2018-2019 年和2019-2020年开展，供试种质的种子分别于2018 年10 月11 日和2019 年10 月17 日播种于装有营养土[泥炭土 :蛭石 : 沙 = 3 : 1 : 1 (V : V : V)]的育苗盘中发芽，待幼苗长至3～4 叶期后移栽至位于江苏省农业科学院的南京六合基地(118°37′ E，32°29′ N)和南京农业大学溧水白马基地(119°19′ E，31°62′ N)。两基地均属于亚热带季风气候，试验地土壤为黄棕壤，土壤肥力中等[16]。采用随机区组设置，小区面积为1 m2，3 次重复，每小区内均匀种植9 株多年生黑麦草，随后整个生育期内进行正常的水肥管理，人工除草。

1.3 测定指标

参照《黑麦草种质资源描述规范和数据标准》[17]，在2018-2020 年观测及记录多年生黑麦草各生长发育节点物候期及8 个形态指标。物候期包括播种期、出苗期、分蘖期、拔节期、孕穗期、抽穗期、开花期、乳熟期、蜡熟期、完熟期，均以50%植株进入该生育期为准，计算生育天数。形态指标包括小穗数、旗叶长、倒二叶长、旗叶宽、倒二叶宽、茎粗、第一节间长和株高(营养枝的最高高度)，在开花期后每株取5 个具有花序的分蘖(生殖枝)进行测定。

1.4 数据统计分析

利用Excel 2013 统计物候期和形态指标数据，应用SPSS 24.0 软件进行形态性状的主成分分析及聚类分析[18]；将原始数据进行离差标准化，使结果映射到[0, 1]区间后进行主成分分析，参考南铭等[18]和雷雄等[19]的方法，在主成分因子得分基础上，构建出以主成分特征向量为系数的综合评价函数式进行综合评价，采用Ward 离差平方和法聚类分析[18]，以欧氏距离绘制树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 多年生黑麦草种质关键生育期差异

根据两年秋季播种的大田试验结果，在江苏南京地区，99 份多年生黑麦草种质关键生育期存在较大差异(表2)。其中，不同种质的早期发育差异大，从播种至出苗所需时间(出苗期)和达到分蘖所需时间(分蘖期)的差异较大，变异系数(coefficient of variation, CV)分别达17.06%和20.63%；而不同种质的结种期差异最小，种子达到完熟期的CV 仅3.62%。

表2 多年生黑麦草种质资源的物候期分析Table 2 Phenological analysis of perennial ryegrass germplasm resources

各种质在播种7～18 d 后陆续出苗，其中PI 198958、PI 578758 和PI 403913 出 苗 较快，在播 种7 d 后出苗，而PI 601287、PI 619033 和PI 611036种质出苗慢，播种后需18 d 出苗。各供试种质进入分蘖期所需时间差异大，自主选育的材料R2-4、R2-12 和R2-9 从出苗至分蘖仅历时8 d，而PI 601287、PI 619033 和PI 611036 需历时24 d。

在南京地区秋播多年生黑麦草，各种质于次年4 月初先后进入拔节期，4 月底开始进入孕穗期，7～12 d 后进入抽穗期，5 月初相继进入开花期。各种质在开花期前各发育阶段仍存在较大差异，CV在6.17%以上；但种质间达到种子完熟期的差异较小，在7 月上旬相继达到种子完熟期。其中PI 227020和PI 287853 种质较早进入生殖生长阶段，抽穗、开花和种子结实均较早，播种后需252.0 d即达到种子完熟期(种子收获期)；而PI 619033 和PI 601287 种质较晚进入生殖生长阶段，播种后约310.0 d 才能收获种子。

2.2 多年生黑麦草种质的形态学差异

各形态性状指标两年观测值基本一致，2019 年平均旗叶宽及第一节间长较2020 年平均旗叶宽及第一节间长稍大，其他指标均较2020 年小(表3)。总体来看，8 个形态性状在供试种质间差异明显，各供试多年生黑麦草种质间各形态性状均存在显著差异(P＜ 0.05)，变异较为丰富，变异系数在22.63%～44.11%，其中倒二叶长的变异系数最大，高达44.11%(2019 年)和40.94% (2020 年)，小穗数变异系数最小，为24.86% (2019 年)和22.63% (2020 年)，除小穗数外，其他指标性状的变异系数均大于27%。各形态指标变异系数从大到小依次为倒二叶长 ＞ 旗叶长 ＞ 倒二叶宽 ＞ 第一节间长 ＞ 茎粗 ＞ 旗叶宽 ＞ 株高 ＞ 小穗数。

表3 2019 年和2020 年多年生黑麦草种质主要形态性状差异分析Table 3 Analysis of main phenotypic traits of perennial ryegrass germplasms in 2019 and 2020

2.3 基于形态指标的多年生黑麦草种质聚类分析

以上述8 个形态学指标的两年均值为依据，将原始数据进行离差标准化后进行聚类分析。在欧氏距离为8.5 时，99 份种质材料被分为4 个类群(图1)。第Ⅰ类包括W6 20468、PI 593651、PI 601287、PI 632542和PI 265340 等25 份种质，占整个种质群的25.3%；第Ⅱ类包括PI 618999、PI 287851 和PI 619474 等12 份种质，占整个种质群的12.1%；第Ⅲ类包括PI 311447、PI 610920、PI 403863 等46 份种质，占整个种质群的46.5%；第Ⅳ类共16 份种质材料，包括除R2-9 外的9份自主选育的种质及PI 598839、PI 577273 和PI 610958等国外引进的7 份种质，占整个种质群的16.2%。

图1 基于8 个形态性状特征的多年生黑麦草种质聚类图Figure 1 Dendrogram of perennial ryegrass germplasm based on eight phenotypic trait

对4 个类群的形态性状进行归元统计和多重比较，第Ⅰ类种质中小穗数、旗叶长、倒二叶长、茎粗、旗叶宽及倒二叶宽均最高，其中小穗数达24.18 个，倒二叶长达18.89 cm，茎粗为2.13 mm，表明其生长较为旺盛，植株粗壮且较为高大，适宜作为牧草育种材料；第Ⅱ类和第Ⅲ类种质性状表现则较为居中，小穗数在20.12 个，茎粗1.70 mm；第Ⅳ类种质中株高最低(4.28 cm)，茎粗最细(1.30 mm)，旗叶和倒二叶长最短，分别为5.47 和6.31 cm，综合来看，此类群种质植株低矮，叶片细小，具有优良的草坪草特性(表4)。

表4 供试种质不同类群间形态性状比较Table 4 Comparison of phenotypic traits among four types of test germplasms

2.4 多年生黑麦草种质形态指标的主成分分析及综合评价

对上述8 个形态学指标的两年均值进行标准化处理，根据主成分分析，得出4 个主成分因子，可代表原有指标87.2%的信息量，各因子的权重系数分别为0.597、0.160、0.106 和0.074，根据主成分分析法，进一步评价99 份多年生黑麦草种质。各种质资源的综合形态指标得分(表5)显示，综合得分较高的5 份种质是W6 20468、PI 593651、PI 632542、PI 601287 和PI 265340，表明这5 份种质植株高大、叶片宽阔，可以作为优良的牧草型多年生黑麦草育种材料；而R2-12、PI 610958、PI 577273、R2-3 和PI 598839 5 份种质的形态指标综合得分较低，是优良的草坪型种质。

表5 供试种质的综合得分Table 5 Factor scores of test germplasms

3 讨论

种质资源是育种工作的基础，而分析种质资源的遗传背景是植物育种突破的关键[20]。本研究通过连续两年观测发现，供试种质的物候期及其形态性状均存在明显的差异，且所有性状的变异系数值均高于20%，说明多年生黑麦草种质资源相对丰富，具有丰富的遗传多样性，适合品种筛选[21]，新品种培育及改良的发展潜力较大。PI 593651 和W6 20468种质的植株高大且粗壮，适宜作为牧草育种材料，而自主选育R2-3、R2-6 和R2-10 等种质叶片细小，植株低矮，具有优良的草坪草特性，为进一步开展育种工作奠定了基础。

根据多年生黑麦草种质的8 个形态性状，99 份多年生黑麦草种质被聚为4 类，第Ⅰ类评分较高，为牧草型种质材料，第Ⅳ类评分较低，为草坪型种质材料。第Ⅰ类牧草型种质资源多为美国的选育品种，它们的植株高大、粗壮，其旗叶长、倒二叶长、旗叶宽、茎粗及倒二叶宽等指标数值均较高，而第Ⅳ类草坪型种质材料的植株矮小及叶片细小，尤其是自主选育群体，除了株高、旗叶长、倒二叶长、旗叶宽、茎粗及倒二叶宽均最小外，其出苗期(10.6 d)及分蘖期(18.9 d)均早于牧草型种质(第Ⅰ类)的出苗期(12.0 d)及分蘖期(24.6 d)，但整个生育期(288.9 d)却晚于牧草型种质(278.8 d)，这表明第Ⅳ类种质还具有成坪快、生长持续时间长的优良草坪特性。此外，第Ⅰ类群中PI 632 542，其株高中等、小穗数最高，生殖生长旺盛，种子生产潜力较高。第Ⅳ类群中自主选育R2-3、R2-6 和R2-10 等种质叶片细小，植株低矮，但小穗数较低，二者相互杂交可选育出植株低矮、叶片细小及种子生产潜力较高的品种，将作为未来的育种目标之一。此外，聚类分析还表明，4 类多年生黑麦草群体中，来自同一区域甚至同一国家的种质资源并没有聚为一类，这与王建丽等[22]和姜慧新等[23]的研究结果一致，可能与多年生黑麦草种质资源的相互交叉利用有关，说明地理来源并不是造成种质资源遗传多样性的唯一因素。

本研究供试种质在南京地区均能完成整个生育期的生长，生育期范围为252.0～310.0 d，均值为281.4 d，高于郭孝和陈二秋[24]、王向涛等[25]、王同军等[26]分别针对多年生黑麦草在中原地区、西藏及低纬度高海拔地区等地域的生育期(105～292 d)，这可能是由于本研究播种期在秋季(10 月中旬)，造成部分种质出苗较慢，影响后续发育进程。秋播是长江流域以南地区的多年生黑麦草作为草坪或牧草生产利用的主要方式，因此本研究采用秋播，评价结果对实际生产和育种工作具有一定借鉴价值。

本研究仅针对多年生黑麦草种质资源的主要形态性状进行了分析评价，有关多年生黑麦草种质的牧草品质性状、抗逆性以及分子水平上的研究还有待深入。本研究在南京地区开展，年份间的各指标数据差异不显著。但由于形态学标记易受环境条件影响，故今后的研究中，可增加多地点试验。

4 结论

通过两年田间试验记录并分析供试的99 份多年生黑麦草种质形态表型，结果表明，各种质形态性状上差异显著，基于主成分分析的综合得分较高和较低的种质，通过聚类分析将99 份种质资源分为4 类，各种质类群间形态性状差异明显，种质类群Ⅰ具有优良的牧草特性，种质类群Ⅳ具有优良的草坪草特性。