不同产地北柴胡种子挥发油组分及表型性状评价

范 娅， 刘 丽， 杜 衎， 孙 燕， 刘兆倩， 冯海洋， 张颖颖， 高德民

(1.山东中医药大学药学院， 济南 250355； 2.山东中医药大学中医学院， 济南 250355)

北柴胡(BupleurumchinenseDC.)是伞形科柴胡属多年生草本植物，其根作为柴胡入药，主要活性成分是柴胡皂苷和挥发油[1]，具有解表和里、疏肝解郁，升举阳气的功效[2]，临床上常用来治疗炎症性疾病和感染性疾病[3]。柴胡在北半球分布广泛，自然生态多样，气候类型复杂，品种多样性丰富[4-6]，导致柴胡种子表型性状地理变异显著。据研究，北柴胡种子的种长、千粒重、含水量与地理分布密切相关，且差异显著[7]。但关于北柴胡种子性状变异与地理气候因子相关性的研究较少，影响了柴胡大田推广和品种选育。

挥发油是一类植物次生代谢产物，在植物信号传递过程中发挥着重要作用[8]，而挥发油成分和含量不仅影响植物种子的活性，还能进一步影响植物的生长发育和药材的品质[9]。北柴胡种子油管中油腔较大，且胚乳中含有脂肪油滴，具有香气，但在常温保存下生活力极易丧失。辛霞[10]研究表明，种子中脂肪的代谢与种子活力具有一定的相关性。但关于柴胡种子中挥发油与活性关系的研究仍未见报道。

本研究对不同来源北柴胡种子的表型性状进行分析，揭示北柴胡种子表型性状变异与地理气候因子的关系，同时利用气相色谱质谱联用技术对北柴胡种子挥发油成分进行分离和鉴定，比较不同来源的挥发油成分的差异，结合形态学和分子生物学的研究数据，旨在为北柴胡种源鉴定及种子质量评价提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

本实验所用的北柴胡种子均为栽培品种，于2020年10月上旬收集完成，并由山东省农业科学院分子实验室ITS基因序列鉴定为北柴胡种子，样品信息如表1所示。凭证标本存放于山东中医药大学标本室(SDCM)。

表1 6个北柴胡种子样品信息

1.2 方 法

1.2.1表型性状测定

参照张浩等[11]的方法测量种子的种长、种宽和种厚；参照何庆海等[12]的方法精确测量种子的千粒重和含水量，每组试验设3次重复。

1.2.2生活力测试

生活力测试的原理为无色溶于水无色的2,3,5-tryphenyl tetrazolium chloride(TTC)与植物新陈代谢所产生的氢离子相结合产生红色复合物[13]。根据Norton等[14]的研究稍加改动，使用1% TTC溶液浸泡柴胡种子，37 ℃下浸泡18 h后，纵切种子，在光学显微镜下观察种子染色情况。没有被染红的种子记为没有活力。每组试验设3次重复。

1.3 挥发油提取

北柴胡种子粉碎精确称量500.00 g，加入6 000 mL的蒸馏水，使用Clevenger的装置进行水蒸气蒸馏，持续回流提取8 h，收集挥发油[10]，加入适量无水Na2SO4，离心后收集挥发油于棕色玻璃瓶中，-20 ℃的冰箱中保存备用。

采用气质联用技术对所得挥发油进行分析，实验条件如下，GC条件：色谱柱Agilent HP-5(30 m×250 m×0.5 m)，进样口温度290 ℃，程序升温：初始温度40 ℃保持3 min，然后以每分钟10 ℃直到280 ℃保持20 min。运行时间47 min。载气为高纯氦(纯度≥99.9%)，分流比100∶1，流速1 mL/min，进样量1 L，去除溶剂峰。MS条件：EI离子源，全扫描模式采集数据，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，传输线温度290 ℃，电子轰击能量70 eV，扫描范围m/z 35～600全扫描。

1.4 数据分析

采用SPSS 21.0软件进行数据整理和统计分析，变异系数计算公式：

利用所得质谱图与标准质谱库NIST 08进行比对，初步获得化合物信息，同时根据质谱信息，进一步人工解析与文献进行比对确认。使用峰面积归一化法确定挥发油各成分相对百分含量。使用SPSS 21.0软件对所得的挥发油成分进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 种子表型性状分析

如表2所示。北柴胡种子形态差异变化较大，种长范围在2.724～3.358 mm之间，长宽比在2.729～3.239之间，千粒重在1.129～1.688 g之间，含水量在6.32%～8.86%之间，生活力在40%～65%之间。B 4、B 5、B 6与B 1、 B 2和B 3相比，B 4、B 5、B 6的长宽比范围为2.997～3.239 mm、千粒重为1.630～1.688 g、含水量为7.75%～8.86%，均高于B 1、B 2、B 3的北柴胡种子；但B 4、B 5、B 6的生活力范围为40%～46%，低于B 1(48%)、B 2(65%)和B 3(49%)。说明不同来源的北柴胡种子的形态和性状指标均存在显著性差异，其性状存在较大的变异，遗传信息丰富[7]。

表2 6种北柴胡种子物理特性信息采集

2.2 北柴胡种子表型性状变异分析

变异系数常用来表示表型多样性，其大小间接反映了群体多样性的丰富程度。变异系数越大，群体间离散性越大，即表型多样性越丰富；变异系数小则表明该群体的性状离散度低，表型多样性差[15]。使用SPSS 21.0软件对北柴胡种子的表型性状进行变异分析结果(表3)表明，其表型变异系数(CV)为生活力>千粒重>含水量>种长>种厚>种宽；性状的相对极差(R′)可以用来衡量群体内的极端变异程度[16]，而相对极差的大小则为生活力>含水量>种长>种厚>种宽>千粒重。从总体来看，种宽和种厚的变异程度相对较小，而生活力和含水量的变异程度相对较大。

表3 北柴胡种子表型性状变异分析

2.3 表型性状与地理气候因子相关性分析

种子表型性状与地理气候因子进行相关性分析显示(表4)，千粒重与含水量、种宽和年平均温度呈显著正相关(p<0.05)，含水量与种宽、经度和纬度呈显著性正相关，种宽和种厚与年平均温度呈显著负相关，说明地理位置及温度对种子的表型性状有较大影响[17]。戚文涛等[7]研究发现，北柴胡种子的种长、种宽、种厚及千粒重等指标随经度的升高而改变，含水量随海拔的降低，降水量的增加而增加。千粒重是衡量种子质量的指标之一，柴胡种子籽粒大小对植物苗期生长速度及植株生物学产量具有重要影响[18]。余马等[19]研究发现，柴胡种子的千粒重很容易受到环境的影响，基因型与环境之间存在很强的相互作用。这与本研究结果一致。付尧等[20]发现，种子含水量与种子活力密切相关，然而本研究发现，地理气候因子和种子的表型性状等因素对种子的生活力没有显著影响，这可能是由于储存时间与条件、种子成熟度和品种之间的差异等因素导致[19,21]。

表4 表型性状与地理气候因子相关性分析

2.4 种子挥发油提取率

如表5所示，挥发油提取率整体较低，挥发油提取率B 1>B 2>B 6>B 3>B 4>B 5，B 1的提取率明显高于其余5个品种，说明品种间的差异较大。柴胡挥发油颜色差异也较为明显，B 1和B 2颜色为浅黄色，B 3为深黄色，B 4、B 5、B 6颜色相近，为亮黄色。挥发油含量整体提取率较低可能是由于种子处在休眠期，种子体内代谢活动缓慢，而挥发油作为次级代谢产物，其含量受休眠时间的影响。

2.5 北柴胡种子挥发油成分鉴定

对收集到的挥发油进行GC-MS分析。经过比对和分析，6个品种共鉴定出49种化合物(表6)，来自山东济南的B 1和B 2分别鉴定出12种化合物和14种化合物。来自甘肃定西的B 3共鉴定出23种化合物；来自内蒙古赤峰的B 4共鉴定出23种化合物；来自山东淄博的B 5共鉴定出25种化合物；来自黑龙江伊春的B 6共鉴定出23种化合物。其中有α-caryophyllene(α-石竹烯)和β-caryophyllene(β-石竹烯)为共有成分，占总成分的2.65%～56.88%。在B 5样品中所占比例最少，为2.65%，在B 2样品中所占比例最高，为56.88%。由表6可知，不同产地的北柴胡种子挥发油成分含量差异较大。本试验鉴定的北柴胡种子挥发油成分与罗颖[9]研究的来自湖北地区的北柴胡种子挥发油成分差异较大，造成成分差异的原因可能与储藏条件[22-24]、采集地点、海拔和休眠日期有关[25-27]。

表6 6种北柴胡种子挥发油成分及其相对含量

2.6 北柴胡种子挥发油成分聚类分析及主成分分析

使用SPSS 21.0软件对所得挥发油成分进行聚类分析，使用方法为Ward法，聚类结果如图1所示，当平方欧式距离为20时，聚类分为两类。B 1与B 2聚为一类，B 3～B 6聚为一类。当平方欧式距离为5时，聚类分为四类，其中B 4、B 5和B 6聚为一类，B 1、B 2和B 3分别聚为一类，其聚类结果表明，不同品种的北柴胡种子化学成分存在较大差异。

图1 6种北柴胡种子挥发油成分聚类分析

对所有北柴胡种子挥发油成分进行主成分分析，依据特征值Total>1的条件进行选择，由主成分1和主成分2进行衡量，主成分1的方差贡献率为46.23%，主成分2的方差贡献率为27.70%，累计贡献率为73.93%，计算各样品得分绘制主成分分析的空间成分图(图2)，B 3与其他样品差异较大，单独归为一类，B 4、B 5和B 6这3种样品成分最为相似，聚为一类。B 1和B 2成分具有一定差异，各自归为一类。主成分分析结果与聚类分析结果基本一致。

图2 6种北柴胡种子挥发油成分主成分分析

表6(续)

2.7 挥发油共有成分与表型性状相关性

参照Mahboobeh等[28]的研究方法，对北柴胡种子挥发油共有成分与种子生活力进行相关性分析，结果表明，α-石竹烯与β-石竹烯生活力分别呈显著相关(p<0.05)和极显著相关(p<0.01)。α-石竹烯与β-石竹烯是双环倍半萜类化合物，是植物挥发性成分的重要组成部分，主要由胞质的甲羟戊酸途径合成[29]。北柴胡种子的生活力除遗传特性外，还与种子的成熟度、萌发和劣变等生理过程有密切联系。随着种子生活力的上升，各种代谢也逐渐活跃，其代谢产物种类也增加[30]。其中B 4、B 5和B 6共有成分α-石竹烯和β-石竹烯占其总成分的2.65%～4.12%，其生活力在40%～46%之间，总体生活力较低。B 2的共有成分含量为56.88%，其生活力最高为65%，表明共有成分α-石竹烯与β-石竹烯的含量与生活力呈正相关关系。生活力常用来表示种子的生存能力，是评价种子的质量的重要指标，根据挥发油成分的差异情况，可为北柴胡种子的质量鉴别提供参考依据，但关于具体代谢机制和内在联系，有待进一步研究[31]。

3 结 论

本实验通过对北柴胡种子表型性状进行测量分析，同时探究了北柴胡种子表型性状与地理气候因子的关联，结果表明，年平均温度与千粒重呈显著正相关，与种宽和种厚呈显著负相关，经纬度与含水量呈显著性正相关，说明地理位置及温度对于种子的表型性状有较大影响。同时是对6种北柴胡种子挥发油进行提取鉴定，共鉴定出49种化合物，其中有β-石竹烯和α-石竹烯为共有成分，且共有成分含量差异较大，共有成分含量与生活力呈正相关，本研究首次系统研究了不同来源北柴胡种子生活力与挥发油成分之间的关系，其结果将为北柴胡种子质量评价和种子质量标准的建立提供新的理论依据，并为北柴胡种子的种源鉴定与筛选提供参考依据。后续在此基础上可进一步研究不同产地北柴胡种子对产量的影响。