盐酸洛美沙星输入方式对水中反硝化过程的影响

杨美萍,何江涛*,邹 华,邓 璐,张金刚

(1.中国地质大学(北京)水资源与环境学院，北京 100083;2.中国地质大学(北京)水资源与环境工程北京市重点实验室，北京 100083)

0 引 言

近年来，环境中抗生素对反硝化过程的影响已被多项研究证实。Chen等研究指出诺氟沙星浓度从0 μg·L增加到100 μg·L时，硝酸盐去除率从0.68 mg·L·h降低到0.44 mg·L·h；Ahmad等研究表明1.0 mg·L磺胺二甲嘧啶和金霉素对亚硝酸盐的抑制率分别为82.0%和31.1%；D’Alessio等研究发现单独使用莫能菌素或磺胺二甲嘧啶对亚硝酸盐还原无影响，而莫能菌素、林可霉素和磺胺二甲嘧啶的联合使用可通过抑制亚硝酸盐的还原影响反硝化过程。根据这些研究可以看出，反硝化过程所受影响与抗生素的种类、浓度以及联合使用息息相关。

此外，有研究指出抗生素的输入方式也是重要的影响因素。例如，Yi等研究发现在厌氧和好氧环境交替条件下，一次性输入2 mg·L环丙沙星对总氮去除无影响，而连续输入可使其去除率减少15.6%，且有亚硝酸盐积累的现象；Chen等研究表明一次性输入磺胺甲恶唑的浓度越高，对反硝化活性影响越大，分阶段连续输入由低到高浓度的磺胺甲恶唑，在0.1 mg·L增加至2 mg·L时反硝化活性逐渐减弱，而2 mg·L增加至100 mg·L时反硝化活性有所恢复；Li等设计了连续6个周期更换上清液以及输入10 mg·L盐酸金霉素的实验，结果表明硝酸盐去除率不受影响，但去除速率降低了67.0%；姚晓婧研究发现，在与文献[6]相同的实验条件下，连续输入1 mg·L盐酸金霉素可使硝酸盐去除率降低了27.78%，明显抑制了反硝化过程。在上述这些研究中多采用模拟实验的方式，环境中抗生素的输入方式主要有一次输入、间断输入和连续输入，在一定程度上可分别反映含抗生素等污水和废水一次性、分批次进入环境介质，或者畜牧养殖场、污水处理厂等场地长期连续排放到水环境和土壤环境中等情景。从已有的研究结果来看，抗生素输入方式对反硝化过程有明显影响，但是缺少抗生素总量相同时，不同输入方式对反硝化过程影响的对比研究。此外，盐酸洛美沙星(Lomefloxacin Hydrochloride,LOM)污染很常见，在水环境和城市污水处理厂中抗生素的检出浓度多集中在每升纳克级到微克级之间，医疗相关的水环境中可检测到浓度高于每升毫克级的抗生素。因此，进一步探讨不同浓度抗生素在总量相同、输入方式不同时的影响，对揭示水土环境中不同抗生素污染情景具有重要的实际意义。

基于此，本文选取典型抗生素LOM，分别以一次输入和两次输入两种方式开展批实验，探究水环境和医疗废水环境浓度(200 ng·L和2 mg·L)条件下LOM对反硝化过程的不同影响，并从微生物响应方面探究其影响机制，以期为水土环境中不同污染模式下抗生素对反硝化过程产生的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 抗生素的选择

Zou等研究表明，氟喹诺酮类抗生素LOM在低浓度条件下对(假单胞菌属)、(寡养单胞菌属)和(无色杆菌属)占主导的反硝化细菌有较强的抑制作用，其抗菌机制是抑制核酸的转录和复制，影响细胞活性和酶的合成，具有抗菌谱广、作用强、高效等特点，溶解度为27.2 mg·mL。因此，本实验选取第三代氟喹诺酮类抗生素LOM作为典型抗生素。实验所用LOM购置于上海麦克林生化科技有限公司，其纯度高于98%。

1.1.2 碳源的选择

纳米乳化油是一种新型绿色缓释液态碳源，具有廉价、无毒、缓释和长效等特性。在以往抗生素对反硝化过程影响的研究中，纳米乳化油在维持稳定的反硝化条件以及多个实验周期顺利进行等方面取得了良好的效果。因此，本研究同样选择纳米乳化油作为碳源，以营造稳定的反硝化环境。

1.1.3 反硝化菌的选择

水环境中有多种反硝化菌，为保证实验更贴合真实的水环境状况，选择上海甘度环境工程有限公司提供的菌种。该菌种提取于自然环境中的混合反硝化菌，主要是由假单胞菌属、产碱杆菌属、科奈瑟菌科、红螺菌科、芽孢杆菌科、纤维粘菌科等组成的反硝化菌群，对总氮的去除效率大于90%，适应温度为10 ℃～60 ℃，pH值为6～9。

1.2 实验方法

1.2.1 实验设计

本研究共设计5组实验，每组包含3个平行对照，以保证实验结果的准确性。每个反应体系装有1 L的反应溶液，反应溶液含有常规组分NaHCO(质量为0.208 0 g)、NaSO(0.073 9 g)、NaCl(0.041 1 g)和污染组分KNO(0.360 9 g)。溶液pH值调节至7.1±0.1，经高压灭菌锅灭菌和氩气吹扫20 min后，加入0.75 g反硝化菌剂和3 mL纳米乳化油密封，最后利用锡箔纸包裹反应容器，为反硝化菌提供避光环境以及防止抗生素的光解。

表1 各反应体系LOM浓度和投加方式Table 1 Concentrations and Adding Methods of LOM in Each Reaction System

1.2.2 实验装置

模拟实验装置如图1所示。其中，反应容器为1.5 L的广口瓶，装有1 L反应溶液；用套针和探针式温度计穿透的橡胶塞密封，套针用于取样，温度计用于监测反硝化环境的温度。

图1 实验装置示意图Fig.1 View of Experimental Setup

1.3 分析方法

表2 PCR引物序列Table 2 Sequences of Primers in PCR Conductions

2 结果分析与讨论

2.1 常规指标及氮素浓度的变化

各反应体系的常规指标温度()、pH值和总有机碳平均值如表3所示。温度和pH值会影响微生物的反硝化速率。当<15 ℃，pH值小于6.5或大于9时，反硝化速率会下降。实验两个阶段内温度在20.50 ℃～20.90 ℃之间波动，pH值在7.57～8.18之间波动，均属于正常的反硝化环境。总有机碳可反映反硝化菌维持正常生命活动所需碳源是否充足，实验周期内总有机碳平均值为164.89～286.38 mg·L，变化范围较大。其原因是微生物的利用和定期取样使纳米乳化油含量逐渐减少，但各反应体系总有机碳均大于115 mg·L，满足反硝化过程所需碳源，其不会成为制约反硝化过程的因素。

表3 各反应体系温度、pH值和总有机碳平均值Table 3 Average Values of Temperature,pH and TOC of Each Reaction System

表4 各反应体系去除率和抑制率Table 4 Removal and Inhibition Rates of in Each Reaction System

驯化阶段的Ⅴ周期也是正式实验阶段的空白周期；Ⅰ～Ⅳ误差棒表示15个平行样之间标准差，Ⅴ～Ⅷ误差棒表示3个平行样之间标准差图2 Ⅰ～Ⅷ周期和浓度变化Fig.2 Concentration Variations of and in Ⅰ-Ⅷ Cycles

2.2 反硝化动力学特征

反硝化过程硝酸盐的还原符合一级动力学模型和Monod动力学模型。本文对各反应体系进行动力学拟合，以期获取拟合参数来进一步说明LOM对反硝化过程的影响。

2.2.1 一级动力学模型

图3 Ⅴ～Ⅷ周期各反应体系还原一级动力学曲线Fig.3 First-order Kinetic Plots of Concentrations for Each Reaction System in Ⅴ-Ⅷ Cycles

2.2.2 Monod动力学模型

表还原一级动力学拟合方程及参数Table 5 First-order Kinetic Fitting Equation and Parameters of Concentration

表6 各反应体系最大还原速率随周期变化Table 6 Variation of Vmax with Cycle for Each Reaction System

2.3 微生物数量和活性

误差棒表示各周期OD600值或OD490值标准差图4 Ⅴ～Ⅷ周期各反应体系OD600和OD490平均值柱状图Fig.4 Histograms of Average Values of OD600 and OD490 for Each Reaction System in Ⅴ-Ⅷ Cycles

投加抗生素后微生物数量和活性的变化可以反映抗生素对反硝化过程的影响。细菌数量用菌悬液在600 nm波长处测定的吸光度表征，吸光度越大，细菌数量越多；细菌活性用LDH释放试剂和LDH检测工作液孵育后的菌悬液在490 nm波长处测得的吸光度表征，LDH释放也被看做细胞膜完整性的重要指标，吸光度越大，具有活性的细胞数量越多。Ⅴ～Ⅷ周期各体系OD和OD平均值如图4所示。各反应体系实验周期的细菌数量和活性均小于空白周期，且随周期的进行逐渐减小。分析其原因为LOM导致了DNA断裂、细胞死亡和细胞膜破裂，使细菌数量和活性均减小，进而抑制了反硝化过程。

图5 各反应体系的OD600和OD490抑制率及其相关性Fig.5 Inhibition Rates of OD600 and OD490 for Each Reaction System and Their Correlation

2.4 微生物的丰富度、多样性和群落结构

表7 微生物群落Alpha多样性指数Table 7 Alpha Diversity Indexes of Microbial Community

为进一步说明微生物受LOM不同输入方式的影响，对各样本物种丰度进行聚类分析，结果如图6所示。图6右侧揭示了属层面相对丰度较大的20种菌属，左侧是对各样本进行聚类而建立的聚类树。各反应体系的6种主导菌属中，、(苍白杆菌属)、(无色杆菌属)、(固氮螺菌属)、(鞘氨醇杆菌属)和(肠杆菌属)均为水环境中典型的反硝化菌属，具有较强的反硝化作用。投加抗生素后的Ⅷ周期，各反应体系主导菌属的丰度发生变化。其中，#1体系Ⅷ周期末的主导菌属丰度减小，丰度增大；#2和#5体系在Ⅷ周期末分别增加了11.1%和9.57%，这两组体系抗性基因丰度大，微生物对抗生素有一定抵抗力，高浓度体系中部分微生物大量死亡使丰度增加；#3体系的主导菌属和变化较小；#4体系的逐渐被取代。由聚类结果可以看出，含LOM体系与不含LOM体系的物种丰度有一定差异，而同一体系的物种丰度在Ⅶ周期和Ⅷ周期趋于聚类，相似度较高，没有显著性差异(>0.05)，表明Ⅷ周期末不能体现微生物群落结构变化受输入方式的影响，这可能与群落结构的响应滞后于细菌数量和活性有关。

图6 各样本物种相对丰度聚类图Fig.6 Cluster Diagram of Species Relative Abundance of Each Sample

2.5 抗性基因及其潜在宿主

抗性基因与内参基因比值单位为copies/16SrRNA;图(b)中,**表示p<0.01，*表示p<0.05图7 抗性基因聚类热图及其与细菌菌属的Person相关性聚类热图Fig.7 Cluster Heatmaps of ARGs and Person Correlation Between ARGs and Bacterial Genera

细菌耐药性是对试图阻止其生长的外界条件的自然适应。微生物处理含抗生素污水往往会产生抗性基因(ARGs)，并通过外排抗生素、修饰抗生素作用靶点、保护细胞核糖体和使抗生素失活等方式来减少抗生素对微生物的毒害作用，并使微生物保持正常的脱氮能力。本研究检测了反硝化菌的6种氟喹诺酮类抗性基因(、、、、和)，抗性基因聚类热图以及抗性基因与细菌菌属Person相关性聚类热图如图7所示。在6种抗性基因中，丰度最高，在#2体系内有较高丰度，其他抗性基因丰度均小于0.01 copies/16SrRNA，可忽略不计。由各样本抗性基因聚类树可知，不同反应体系抗性基因丰度变化不同，进一步进行显著性差异分析表明：各反应体系在Ⅶ周期末到Ⅷ周期末的抗性基因丰度变化不受抗生素输入方式影响(>0.05)，这可能与抗性基因的响应具有滞后性有关。此外，抗性基因与细菌菌属的Person相关性显示，、和菌属分别为抗性基因、和的潜在宿主，在#2和#5体系中丰度较大。分析其原因为投加LOM后，的潜在宿主丰度增加并形成优势种群，使微生物携带的抗性基因增多，但可能是由于具有低抗性或微生物大量死亡，反硝化过程仍受到了不同程度的抑制作用。

本文研究结果表明高浓度抗生素一次性输入在短期内对反硝化过程的影响不容忽视，这为水土环境中抗生素不同污染模式下对反硝化过程产生的影响提供参考，但由于实验周期较短，长期以不同输入方式输入抗生素对反硝化过程以及群落结构与抗性基因的影响尚不清楚，有待进一步研究。

3 结 语