UPLC-MS/MS在蛋鸡中利巴韦林代谢研究中的应用

陈国， 许秀琴

(宁波市农业科学研究院，浙江 宁波 315101)

利巴韦林又名病毒唑，是一种广谱抗病毒药物，在畜牧业和水产养殖业上有广泛的应用，主要用以预防和治疗病毒性疾病[1-2]。若不规范使用，致使动物体内残留，人类长期食用此类食品，导致体内利巴韦林残留过量，会产生一系列毒副作用，如遗传毒性、生殖毒性、致癌等[3-4]。本文以蛋鸡为研究对象，采用UPLC-MS/MS分析方法，开展鸡肉和鸡肝中利巴韦林及其代谢物残留消除规律研究，以期为禽产品质量安全风险评估和预警提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

主要仪器有液相色谱串联质谱联用仪(Water 2695 XevoTMTQ MS)，电子天平(Sartorius Quintix 124)，氮吹仪(美国Organomation N-EVAP 112)，离心机(SIGMA 3K15)，漩涡振荡器(IKA VORTEX GENIUS 3)。

主要试剂有乙腈(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、甲酸(色谱纯)，均购于美国Merck公司。利巴韦林标准品(99.9%纯，Dr.Ehrenstorfer公司)，TCONH2标准品(99.9%纯，英国阿波罗科学有限公司)，RTCOOH标准品(99.9%纯，美国USP标准品公司)，13C5-利巴韦林标准品(99.9%纯，Dr.Ehrenstorfer公司)，利巴韦林颗粒(每包50 mg，新博林)。

试验用蛋鸡84只，200 d龄，设置重复A、B 2组，光照、温度、饮水等条件遵照养殖场正常条件设定。

1.2 方法

1.2.1 试验动物给药方案

参照《兽药残留试验设计规范》，利巴韦林原药用无菌生理盐水配制成30 mg·mL-1的溶液，蛋鸡给药前禁食12 h，自由饮水，采用30 mg·kg-1的给药剂量连续用药7 d，分别于断药后4、8、12、24、48、60、72、120、240、480 h取样，每次随机抓取4只鸡取鸡胸肉、鸡肝，分别用样品袋装好，贴好标签，-18 ℃冷冻保存，待测。

1.2.2 样品的提取与净化

精确称取2.00 g样品于50 mL的离心管中，加入100 μL浓度为0.1 mg·L-1的13C5-利巴韦林内标工作液，涡旋均匀，放置0.5 h，加入1 mL超纯水提取，涡旋30 s，超声5 min。再加入9 mL的乙腈，涡旋30 s，超声5 min，涡旋10 s混匀，振荡15 min。9 000 r·min-1离心5 min，转移上清液3.0 mL于10 mL离心管中，待净化。

在提取液中加入40 mg Carbon和60 mg C18 ODS填料，涡旋1 min，5 000 r·min-1离心5 min，移取2.0 mL上清液于10 mL离心管中，40 ℃温度条件下吹干，准确加入1 mL 0.1%甲酸乙腈溶液复溶，涡旋30 s，超声5 min，过0.22 μm滤膜上机。

1.2.3 色谱和质谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-Aq反相色谱柱，规格100 mm×3.0 mm，粒径1.8 μm。流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为甲醇溶液。采用梯度淋洗，流速0.3 mL·min-1，进样体积10 μL。流动相比例：0 min，A—99%，B—1%；2.5 min，A—99%，B—1%；4.0 min，A—85%，B—15%；5.0 min，A—10%，B—90%；5.1 min，A—99%，B—1%；8.0 min，A—99%，B—1%。

离子源为电喷雾正离子模式(ESI+)；监测模式为多离子反应监测(MRM)；电喷雾电压(IS)为3 700 V；离子源温度(TEM)为500 ℃；锥孔反吹气流量为25 L·h-1；脱溶剂气流量为1 000 L·h-1。质谱参数见表1。

表1 质谱的参数

2 结果与分析

2.1 标准曲线

准确称取利巴韦林、RTCOOH、TCONH2标准品0.01 g于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成质量浓度为100 mg·L-1的混合标准储备液。采用内标法定量，将混合标准储备液依次用甲醇、鸡肉基质、鸡肝基质稀释配制成5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 μg·L-1的系列标准工作溶液，以13C5-利巴韦林为内标，浓度为10.0 μg·L-1，进样分析，获得标准工作溶液曲线线性方程(表2)，曲线的回归系数均大于0.998。从表中的斜率比发现，鸡肝的基质效应要比鸡肉强，即使采用内标法也不能很好地消除基质效应。因此，本试验中实际样品分析时采用基质标准曲线进行定量分析。

表2 标准曲线方程及斜率比

2.2 方法的灵敏度、准确度和精密度

在上述条件下，利巴韦林、RTCOOH、TCONH2在样品中定量限分别为0.005、0.02、0.01 μg·kg-1，灵敏度达到分析要求。取鸡肉、鸡肝空白样品进行回收率试验，添加水平分别为5.0、10.0、50.0 μg·L-1，每个浓度重复6次，内标法定量。3个水平添加下，在鸡肉和鸡肝中利巴韦林及代谢物回收率均在70%～99%，组内变异系数未超过10%(表3)，表明LC-MS/MS检测方法具有较好的准确度和精密度。

表3 利巴韦林及代谢物在蛋鸡组织中的添加回收率(n=6)

2.3 残留浓度和消除规律

2.3.1 鸡肝中利巴韦林及代谢物残留浓度及消除规律

按照给药剂量30 mg·kg-1的标准，连续用药7 d后，鸡肝中利巴韦林及代谢物的残留消解结果见表4。蛋鸡经连续多次口服灌喂利巴韦林原药后，4 h时，原药残留含量为88.4 μg·kg-1，其代谢物TCONH2和RTCOOH的含量分别为2 012.1、5 668.5 μg·kg-1，相对其他时间，浓度均处于最高点。说明利巴韦林经口服灌喂后，在肝脏中迅速发生代谢行为，转化为TCONH2和RTCOOH代谢物。从4 h检测结果看，原药浓度显著低于代谢物浓度，也说明利巴韦林在蛋鸡体内没有产生富集作用，而是被转化为代谢物，主要以代谢物形式残留在体内。利巴韦林、TCONH2和RTCOOH在肝脏中残留最后检出点分别为48、60、60 h，也说明了利巴韦林在肝脏中被迅速转化的同时，也被迅速消除排出肝脏组织。在停药60 h后，原药及代谢物均被排出肝脏组织，转移到体内其他组织部位或排出体外。

2.3.2 鸡肉中利巴韦林及代谢物残留浓度及消除规律

鸡肉中利巴韦林及代谢物的残留消解结果见表5，3种物质在4 h时测得最大残留浓度，说明利巴韦林经口喂进入代谢器官，迅速发生代谢作用，原药和代谢物迅速扩散到全身组织。试验结果显示，鸡肉中利巴韦林代谢物残留时间较长，其中TCONH2的最后检出时间为120 h。3种物质在鸡肉中残留消除时间有较大差异，代谢物TCONH2前期在鸡肉中残留量大，残留时间长。

3 讨论

利巴韦林在鸡肝和鸡肉中残留消除试验中发现，在给蛋鸡灌喂30 mg·kg-1利巴韦林原药后，鸡肝中利巴韦林的Tmax为4 h，Cmax为88.4 μg·kg-1；TCONH2的Tmax为4 h，Cmax为2 012.1 μg·kg-1；RTCOOH的Tmax为4 h，Cmax为5 668.5 μg·kg-1；鸡肉中利巴韦林的Tmax为4 h，Cmax为118.5 μg·kg-1；TCONH2的Tmax为4 h，Cmax为763.5 μg·kg-1；RTCOOH的Tmax为4 h，Cmax为90.5 μg·kg-1。原药在鸡肝和鸡肉组织中残留的达峰浓度要低于代谢物TCONH2和RTCOOH。说明了代谢物TCONH2和RTCOOH是利巴韦林进入蛋鸡体内后的主要残留代谢物。

比较2种代谢物TCONH2和RTCOOH，在4 h时，鸡肝中浓度最高代谢物为RTCOOH(5 668.5 μg·kg-1)，鸡肉中残留浓度最高代谢物为TCONH2(763.5 μg·kg-1)，说明不同组织中代谢物的残留分布有组织差异性。RTCOOH在肝脏中起始浓度最高，半衰期为1.7 h，在短时间内消除干净，可能是肝脏作为机体中主要代谢器官，药物残留首先集中在肝脏，随着时间的推移，快速消除，对比鸡肉组织(半衰期为6.9 h)，消除更为迅速。代谢物TCONH2在鸡肝中的Tlast为60 h，在鸡肉中的Tlast为120 h；代谢物RTCOOH在鸡肝中的Tlast为60 h，在鸡肉中的Tlast为60 h，比较而言，代谢物TCONH2在鸡肉中残留时间更长。

从试验结果看，不同组织中药物分布情况不同，鸡肝中代谢物RTCOOH的Cmax浓度高，代谢快；鸡肉中代谢物TCONH2的Cmax浓度高，残留时间长，Tlast为120 h。根据Tlast和药物分布特点，鸡肉可作为利巴韦林的监控靶组织，代谢物TCONH2为靶标物。