一株骆驼源大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验

李璋赟金映红薛晶汪阳汪萍陈古丽夏俊*

（1石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832003；2新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心），新疆乌鲁木齐 830000；3新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830000）

大肠杆菌是正常肠道菌群的重要组成部分，但也导致了多种疾病，带来了巨大的经济损失，尤其是对幼龄动物危害严重[1]。

驼羔患大肠杆菌病表现出厌食、虚弱、发热、排出淡黄色水样便等症状。剖检可见小肠充血、充满气体和液体、肠系膜淋巴结水肿[2]。

2021年，新疆某骆驼园发生多例幼年骆驼腹泻，临床表现为严重水样腹泻，患病驼羔体温升高，可达40℃以上。剖检病死驼羔，可见肠系膜淋巴结肿大，小肠黏膜充血。为明确造成大量驼羔死亡的主要原因，本实验室对分离菌进行细菌培养分离，对分离菌进行革兰氏染色镜检、小鼠致病性试验和16S rDNA基因鉴定后明确分离菌为大肠杆菌，然后进行药敏试验，合理选择药物，有效治疗了该养殖场的驼羔大肠杆菌腹泻病。

1 材料与方法

1.1 主要试验试剂和仪器

1.1.1 主要试剂。脑心浸液培养基（BHI肉汤）购自北京奥博星生物技术有限公司；DL2000核酸Marker购自大连宝生物有限公司；革兰氏染液购自北京索莱宝科技有限公司；90 mm细菌培养皿购自兰杰柯科技有限公司；200 μL移液器购自普兰德（上海）贸易有限公司；1 mL注射器购自武汉市王冠医疗器械有限责任公司；药敏纸片购自青岛易邦生物工程有限公司。

1.1.2 主要仪器。仪器有PCR仪、电泳仪、恒温水浴锅、微波炉、标准型单人超净工作台、恒温培养箱、压力蒸汽灭菌器、电子天平、空气浴摇床、显微镜。

1.2 病料和试验动物

病死驼羔肺脏、肠组织来自新疆某骆驼园；健康小鼠购买自新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心实验动物研究中心。

1.3 引物

参照文献，设计并合成细菌鉴定通用引物：上游引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游引物5'-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3'，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，按照说明书稀释至10 μmol/L，于-20℃保存备用。

1.4 试验方法

1.4.1 大肠杆菌疑似菌株的获取。在无菌条件下，采集驼羔肺脏组织划线接种于BHI培养基上，37℃培养12～24 h；再抽取少量病死驼羔心血和肺脏组织放入BHI液体培养基中37℃振荡培养12～24 h。

1.4.2 革兰氏染色镜检。BHI固体培养基和BHI肉汤均进行革兰氏染色，观察细菌的形态特征和染色特征。

1.4.3 小鼠致病性试验。将已培养出菌株的BHI肉汤给小鼠腹腔注射200 μL/只。同时，设置感染组和空白对照组，空白对照组不进行处理。

1.4.4 16S rDNA基因鉴定。取经纯化培养的细菌肉汤1 μL加入反应体系中进行PCR扩增。模板1 μL，上、下游引物各 1 μL，Mix 12.5 μL，用 ddH2O 将反应体系补充至25 μL。循环条件：94℃预变性5 min，95℃变性 30 s，56℃复性 30 s，72℃延伸 1 min，共30个循环；72℃终延伸10 min。PCR反应结束后进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察电泳条带后回收PCR产物，送上海生工生物公司测序。

1.4.5 药敏试验。将经过纯培养的菌液50 μL滴入BHI固体培养基上，用涂布棒涂布均匀，用镊子夹取药敏纸片均匀放置于培养基上。37℃培养12～24 h，观察抑菌圈直径。

2 结果与分析

2.1 大肠杆菌疑似菌株的获取

在BHI培养基上形成圆形，边缘整齐，表面光滑，半透明，小凸起灰白色、露珠样的菌落，如图1所示。在BHI肉汤中生长良好，均匀浑浊，如图2所示。

2.2 革兰氏染色镜检

革兰氏染色镜检显示，分离菌株为两端钝圆的革兰阴性短杆菌状，如图3所示。

2.3 小鼠致病性试验

感染组小鼠于接种4 h后，开始表现精神沉郁，在接种后24 h内全部死亡（图4）。剖检取小鼠心血进行细菌培养，通过革兰氏染色镜检和16S rDNA PCR鉴定，结果与病死驼羔肺脏组织和肠道中分离到的细菌一致，对照组无异常反应。

2.4 16S rDNA基因鉴定

吸取纯培养菌液进行PCR扩增，分离菌株的16S rDNA扩增结果经1%琼脂糖凝胶电泳，扩增片段约1 500 bp，与预期目的片段大小一致。经测序后其结果经BLAST分析比对，该菌株16S rDNA基因部分序列与大肠杆菌同源性达99%，结合培养特性，鉴定该菌为大肠杆菌（图5）。

2.5 药敏试验

药敏试验结果见图6。该分离菌对替米考星、头孢曲松钠、氟苯尼考敏感；对硫酸阿米卡星中度敏感；对阿奇霉素、左氧氟沙星、头孢拉定、盐酸林可霉素、克林霉素、硫酸庆大、乳酸环丙沙星耐药。

3 结论与讨论

3.1 讨论

大肠埃希菌（Eschericha coli）为革兰阴性菌，两端钝圆，无芽孢，大小为（0.4～0.7）μm×（2.0～3.0）μm，大多有鞭毛，能运动，散在或成对存在[3]。非致病大肠埃希菌是肠道正常菌群的组成部分之一，而致病性大肠埃希菌可引起动物发生腹泻、败血症、衰竭，甚至死亡。动物肠道致病性大肠埃希菌可分为6种，即肠产毒素型大肠埃希菌、肠致病型大肠埃希菌、肠出血型大肠埃希菌、肠侵袭型大肠埃希菌、肠聚集型大肠埃希菌、弥散黏附型大肠埃希菌[4]。

大肠杆菌是所有哺乳动物肠道中某些部位的常在菌[5]。产肠毒素的大肠杆菌能引起肠炎和脱水，是农场中动物大肠杆菌性腹泻最常见的原因[6]。在骆驼饲养场中，大肠杆菌病或大肠杆菌败血症多发生于幼年骆驼，给骆驼饲养场造成巨大的经济损失。大肠杆菌病的临床症状与轮状病毒、冠状病毒、沙门氏菌、球虫感染相似，应在诊断中进行微生物学检测[7]。

驼羔腹泻是最常见的驼羔疾病，多发生在春季产羔后期，发病率和死亡率都很高[8]。其病因除本案例中的大肠杆菌感染外，还有驼羔受寒、饥饱不均等造成消化不良或误食污物等原因。主要症状均为腹泻，但细菌性腹泻时，病初体温升高，患病驼羔食欲减退，之后腹泻，排出粥样粪便，色黄带血或泡沫，随后变为淡白色，有不良臭味[9]；非细菌性腹泻，患病驼羔体温正常，粪便如清水带黄色。由腹泻造成脱水，患病驼羔精神沉郁，卧地不起。

对于本病的治疗，应口服或肠外补充电解质，以恢复体液平衡，同时使用抗生素治疗。此外，为了降低驼羔的死亡率，可以给母驼注射畜群特异性大肠杆菌疫苗或给幼龄骆驼口服疫苗进行免疫。

3.2 结论

本次试验在幼年骆驼中分离出大肠杆菌，明确了造成新疆某骆驼饲养场驼羔大量死亡的原因，并进行了微生物学检测、16S rDNA基因鉴定、小鼠致病性试验、药敏试验。最终确定本株分离自腹泻驼羔的大肠杆菌致病性强，对替米考星、头孢曲松钠、氟苯尼考敏感；对硫酸阿米卡星中度敏感；对阿奇霉素、左氧氟沙星、头孢拉定、盐酸林可霉素、克林霉素、硫酸庆大、乳酸环丙沙星耐药。本次试验对减少骆驼饲养场损失有帮助。