活动性肺结核免疫耗竭及免疫治疗的研究进展

彭 涛，如克亚木·阿不都沙拉木，房 珂，宋维维，丁萌譞，谢 娜，舒占钧

结核病是慢性感染性疾病，目前以抗结核药物治疗为主。而机体的免疫功能对结核病患者病情的发展至关重要，抗结核治疗的效果以及后期复发与否与患者免疫功能的强弱关系密切。在活动性肺结核患者的疾病进程中，结核分枝杆菌（结核杆菌）长期刺激宿主的免疫细胞可导致这些免疫细胞功能耗竭，在免疫耗竭的状态下宿主免疫细胞不能对结核杆菌产生有效的免疫应答，从而使结核杆菌不断增殖，导致在某些时候单纯采用抗结核药物治疗的难度增大。胸腺肽和细胞因子可以增强T细胞对结核杆菌的免疫应答，过继免疫细胞治疗通过外源性补充免疫细胞的方式提高患者的细胞免疫应答，从而以辅助治疗的方式改善免疫耗竭的状况，使结核杆菌能被更好的清除。

1 免疫耗竭的概念及表现

“免疫耗竭”是用来描述当免疫细胞在受到高剂量抗原持续刺激的情况下所导致的一种免疫细胞功能受损的状态。该词的由来可以追溯到20世纪60～70年代。正常的效应T细胞通常会在病原体被清除、炎症被消除后死亡或分化为记忆T细胞。但20世纪90年代Zajac等[1]在感染淋巴细胞性脉络膜脑膜炎病毒的小鼠体内发现了某种特殊表型的CD8+T细胞，这种CD8+T细胞可以持续存在但不具备正常的抗病毒的免疫效应，即不能激发其正常的细胞毒性和有效产生IFN-γ，这些CD8+T细胞似乎在进行一种持续而无效的努力。这种特殊的状态被称为“免疫耗竭”，CD8+T细胞的免疫耗竭可以看成是分化为记忆CD8+T细胞的程序发生了改变[2]。

现以CD8+T细胞举例说明免疫耗竭的表现。与正常的效应CD8+T细胞以及正常的记忆CD8+T细胞相比，耗竭的CD8+T细胞存在许多不同之处，主要表现在以下几个方面。第一，免疫效应功能逐步受损[3]。开始首先是IL-2的产生减少，然后产生减少的是TNF，到了CD8+T细胞严重耗竭阶段的时候IFN-γ的产生减少[4]。第二，多种抑制性受体（inhibitory receptors, IRs）上调并且持续表达[5]。这些IRs本来功能是为了防止免疫应答进行过度而引起病理性免疫反应或自身免疫反应，但是其过度持续地表达会抑制CD8+T细胞的免疫功能。这些抑制性受体主要有：程序性死亡受体1（programmed death 1, PD-1）、淋巴细胞活化基因3、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4、T细胞免疫球蛋白粘液素结合区域3（T cell immunoglobulin mucin 3 polypeptide N terminal,TIM-3）、含Ig及免疫受体酪氨酸抑制基序结构域的T细胞免疫受体等，目前对PD-1的研究较多。第三，增殖能力的改变[6]。正常情况下通过IL-7和IL-15的介导，正常的记忆CD8+T细胞可以进行稳态增殖，具有不依赖抗原而实现自我更新的特性，而耗竭的CD8+T细胞由于信号通路的缺陷，不具备这种特性，它是通过抗原信号来维持其持续增殖[7-8]（见图1）。第四，细胞代谢的改变。由于PD-1抑制磷酸肌醇3激酶和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路，直接影响代谢途径的信号，导致耗竭的CD8+T细胞对葡萄糖的摄取减少和线粒体能量代谢失调[9]。第五，转录调节因子和表观遗传学的改变。耗竭的CD8+T细胞具有和正常的记忆CD8+T细胞不同的转录程序[10]。

图1 T细胞耗竭示意图[7]Figure 1 Schematic diagram of T cell exhaustion[7]

除了CD8+T细胞之外，CD4+T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞等多种免疫细胞均可发生类似的免疫耗竭。

2 活动性肺结核与免疫耗竭

肺结核是一种慢性传染病，由结核杆菌感染引起，是最严重的传染病之一。机体免疫力的强弱与结核病的发展密切相关，固有免疫和适应性免疫均参与到了抗结核感染当中。

固有免疫是机体抵抗结核杆菌感染的第一道防线。包括巨噬细胞、树突状细胞（dentritic cell,DC）、中性粒细胞和NK细胞在内的固有免疫细胞可以通过多种模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）识别结核杆菌。PRRs再启动与固有免疫防御相关的多种细胞功能，包括吞噬、细胞凋亡、自噬、炎性小体的激活[11]。而结核杆菌也可以通过多种机制逃避机体的固有免疫，例如细胞溶质的逃逸，抑制抗菌肽的产生，抑制吞噬体成熟，抑制细胞凋亡，抑制自噬作用，抑制炎性小体激活[12]。

机体抗结核免疫效应的正常发挥还依赖于适应性免疫中的细胞免疫。由于结核杆菌是胞内寄生菌，而由CD4+T细胞分化的Th1分泌的IFN-γ可促进巨噬细胞产生大量活性氧中介物和活性氮中介物杀伤其已吞噬的结核杆菌。而且Th1还能辅助CD8+T细胞的增殖分化，促使CD8+T细胞也分泌IFN-γ来激活巨噬细胞杀灭其已吞噬的结核杆菌，或者使CD8+T 细胞直接通过释放颗粒酶、穿孔素导致感染结核杆菌的巨噬细胞被溶解，从而杀死巨噬细胞内的结核杆菌[13]。所以，在抗结核杆菌感染的过程中，CD4+T细胞发挥着重要的作用[14]。

Roberts等[15]的研究发现，相比于对照组，涂阳肺结核患者体内Th1内的IFN-γ减少，并且在应对卡介苗刺激的应答过程中，叉头状家族转录因子FOXP3、TNF-β和IL-4 mRNA的表达增加，暗示着这组患者出现了免疫抑制。Jayaraman等[16]的研究表明，在感染早期，结核杆菌特异性的CD4+T细胞还能够分泌一些IFN-γ、IL-2和TNF，可是随着感染进展，这些结核杆菌特异性CD4+T细胞产生的IL-2减少，产生TNF的能力也逐渐下降，并且表达多种抑制性受体。Day等[17]的研究发现，与潜伏性结核感染者相比，活动性结核病患者体内结核杆菌特异性CD4+T细胞的增殖能力严重下降。这些都提示CD4+T细胞功能出现障碍，进入了免疫耗竭。由于处于免疫耗竭状态的CD4+T细胞不能有效地介导抗结核杆菌的适应性免疫应答，导致结核杆菌不断增殖，进而造成结核病的不断进展。

CD8+T细胞对于控制结核杆菌感染也非常重要。和CD4+T细胞一样，CD8+T细胞也能够产生一些与抗结核杆菌感染相关的重要细胞因子，如TNF、IL-2和IFN-γ[18]。有研究发现，小鼠慢性感染时CD8+T细胞的减少导致结核杆菌数量增加，表明CD8+T细胞对于控制结核感染是必要的[19]。但是Day等[20]通过结核杆菌慢性感染的小鼠模型研究发现，在抗结核免疫中结核杆菌特异性CD8+T细胞的多功能活性减弱，其增殖能力也有所下降，TNF-α、IL-2和IFN-γ的生成也有减少。并且其在后续的研究中还发现，在结核杆菌慢性感染的小鼠模型以及活动性结核病患者体内，抑制性受体在CD8+T细胞上的表达增高[17]。这些都表明CD8+T细胞出现了免疫耗竭。处于耗竭状态的CD8+T细胞不能有效地参与对抗结核杆菌的免疫应答，会出现细胞毒性功能受损[21]，即颗粒酶和穿孔素等细胞毒性分子的产生减少[22]，不能很好地杀伤被结核杆菌感染的靶细胞，从而导致结核杆菌在体内的载量不断升高。

3 免疫治疗

3.1 肺结核难治的原因 当抗结核药物把结核杆菌清除后，免疫细胞受到结核杆菌持续刺激的状况得到解除，免疫耗竭也就得到改善。然而，单纯依赖抗结核药物治疗活动性肺结核存在很多困难。朱培福等[23]认为，年龄大、生理功能减弱、同时合并严重的基础疾病、肺组织结核空洞的形成以及外周淋巴细胞出现明显的调亡，致使患者免疫功能下降，是导致肺结核难治的主要原因。当然，其他原因还有结核杆菌耐药、患者服药依从性差、医疗机构新的有效抗结核药物品种不足等。这些原因使得体内结核杆菌载量居高不下，持续地刺激机体免疫细胞，导致免疫细胞耗竭，耗竭的免疫细胞不能发挥有效的抗结核免疫应答，并且还使得结核肉芽肿的形成不典型，不能将结核杆菌的感染局限化[24]，从而又使体内的结核杆菌载量进一步增加，形成恶性循环。所以，免疫耗竭可能是导致肺结核发病以及难治的机制之一。

3.2 胸腺肽治疗 胸腺肽是从动物胸腺组织提取的一组可溶性的多肽混合物，可辅助T细胞的发育，增强T细胞对抗原的免疫应答，常用于辅助治疗临床上各种免疫功能降低的疾病，临床常用的主要有胸腺五肽和胸腺素α1。任萍[25]的临床研究显示，在常规抗结核治疗的同时，加用胸腺肽治疗，CD3+T细胞、CD4+/CD8+水平的提升幅度会比单纯采用抗结核药物治疗更大。Liu等[26]的回顾性研究发现，胸腺素α1辅助治疗能降低患者耗竭CD8+T细胞上抑制性受体Tim-3和PD-1的表达，使严重T细胞减少患者的CD8+T细胞和CD4+T细胞数量得以恢复，逆转T细胞的耗竭，从而降低了病死率。孙莹等[27]通过Meta分析发现，胸腺肽联合基础抗结核药物治疗患者的病灶吸收率、肺空洞缩小及闭合率、3个月痰培养转阴率方面均优于单用基础抗结核药治疗患者。所以，胸腺肽也许可作为一种辅助治疗的方式改善活动性肺结核患者的T细胞耗竭。

3.3 细胞因子治疗 被用于结核病辅助治疗研究的一些常用细胞因子主要有IFN-γ、IL-2、人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF） 等。20世 纪90年代，Raad等[28]在1例耐多药的脑和脊髓结核患者使用过6种抗结核药物治疗无明显效果后，对其使用IFN-γ与粒细胞集落刺激因子联合辅助治疗，治疗5个月时，患者的神经系统实质以及影像学方面出现了明显的改善，持续治疗12个月时，大脑和脊髓病变完全消失。Gao等[29]的系统综述中，IFN-γ辅助治疗，尤其是气雾剂治疗，可能对结核病患者有益。但是刘其会等[30]认为，IFN-γ辅助治疗的临床效果不是很理想，持续时间短暂。T细胞耗竭时，IFN-γ是其所缺乏的重要细胞因子，结合上述分析，使用IFN-γ辅助治疗可能会对结核病患者T细胞耗竭有所改善，但是近年来关于IFN-γ治疗结核病的相关研究较少，还需要多中心的大规模的临床试验来对其安全性和疗效进行评估。

IL-2也是结核病细胞因子辅助治疗研究中的常用细胞因子之一。Zhang等[31]的Meta分析显示，IL-2的辅助免疫治疗可以促进结核病患者CD4+T细胞和NK细胞的增殖和分化，改善宿主免疫功能，还可以提高耐多药结核病患者痰涂片和痰培养的转阴率，从而控制肺结核病情的进展，但对结核病患者的胸部影像学并没有明显的改善。

GM-CSF最初被定义为造血生长因子，因为它能促使骨髓祖细胞增殖和分化形成粒细胞和巨噬细胞集落[32]。作为重要抗原提呈细胞的DC也属于髓系细胞，GM-CSF对于DC的增殖和成熟来说至关重要。Chuang等[33]创造了一种新型白蛋白融合GM-CSF的分子，它能增加结核病小鼠的肺和引流淋巴结内DC的数量，增加抗原的提呈，从而使T细胞介导的免疫应答能被有效地激活，改善T细胞耗竭，降低小鼠体内的结核杆菌载量，具有一定应用前景。张雍容等[34]的小鼠模型试验表明，当IL-2或GM-CSF其中之一与抗结核药物联合治疗时，在抑菌率上并没有表现出明显的优势，但是小鼠肺组织的病理损伤有明显的减弱。然而相比于单纯采用抗结核药物治疗，IL-2和GM-CSF共同参与的辅助免疫治疗联合抗结核药物治疗不仅能减少肺部损伤，还能更有效地提高抑菌率，而且还能比其他治疗组在提高小鼠存活率上有明显优势。所以，多种细胞因子联合使用应该可以作为在抗结核药物基础上辅助治疗活动性肺结核免疫耗竭的策略之一。

3.4 过继免疫细胞治疗 过继免疫细胞治疗是一种将自体或异体的免疫细胞在体外用细胞因子激活、扩增后再输给患者，从而直接杀伤抗原的被动免疫治疗。Xu等[35]报道了1例将细胞因子诱导的杀伤性细胞（cytokine-induced killer, CIK）过继免疫细胞疗法联合二线抗结核药物用于耐多药结核病患者治疗的个案，显示出了较好的疗效。唐佩军[13]的一项关于CIK联合抗结核药物治疗的随机对照试验显示，CIK与抗结核药物联合使用可以明显缓解耐多药肺结核患者的呼吸道症状、痰检情况以及肺部病灶的吸收情况。Zhao等[36]的Meta分析显示，细胞治疗具有较好的安全性。Ramos-Espinosa等[37]也表示有证据支持其有效性和安全性。活动性肺结核患者处于免疫耗竭时，体内耗竭的免疫细胞不能对结核杆菌产生有效的免疫应答，所以将免疫细胞经体外扩增后再回输给患者，以补充体内细胞免疫应答的不足，不失为一种有效的策略。

4 结 论

活动性肺结核患者体内的结核杆菌长期持续地刺激免疫细胞可引起免疫耗竭，处于免疫耗竭状态下的免疫细胞难以像正常的免疫细胞那样对结核杆菌发挥有效的免疫应答，使患者体内的结核杆菌载量不断升高，导致在某些时候单纯地使用抗结核药物治疗变得困难，从而容易使结核病不断进展。免疫耗竭可能是导致肺结核发病以及难治的机制之一。

胸腺肽和细胞因子可以增强T细胞对结核杆菌的免疫应答，过继免疫细胞治疗通过外源性补充免疫细胞的方式提高患者的细胞免疫应答，从而以辅助治疗的方式改善免疫耗竭。所以，抗结核药物治疗与多种免疫治疗的联合应用也许是未来治疗活动性肺结核患者免疫耗竭的有效手段。