圈养华南虎钩端螺旋体感染情况调查

朱向蕾 虞坚颐 周立晨

（上海动物园，上海200335）

钩端螺旋体病(Leptospirosis)为致病性钩端螺旋体引起的人畜共患传染病，在世界范围内分布(Levett, 2001)，可感染鼠科、猴科和犬科等多种动物(Desvarset al., 2012)。人或动物通过接触带菌动物的粪便、尿液污染的水和土壤而感染(娄银莹等，2019)，可造成黄疸、急性肾功能衰竭、出血性素质和严重肺部疾病等，因血清型或地域不同，呈现不同的临床表现(McBrideet al.,2005;Goldsteinet al.,2006)。

华南虎(Panthera tigris amoyensis)是国家一级重点保护野生动物，中国特有虎物种，仅249只圈养于各地动物园(2020 年华南虎谱系)，种群保护与繁育工作迫在眉睫。目前已有猫感染钩端螺旋体的报道(Arbouret al.,2012;Murilloet al.,2020)，动物园作为流浪猫、啮齿类动物的常见地，具备形成钩端螺旋体传播途径的条件，圈养华南虎也暴露于传播链的风险之下。除人类外，绝大多数研究集中于宠物犬猫，关于大型猫科动物如华南虎感染情况的研究较少，但钩端螺旋体对华南虎造成的潜在威胁不容忽视，因此对于其感染情况的研究非常必要。

本文采集11家动物园华南虎血液119份，通过分子生物学及血清学手段，开展钩端螺旋体的感染情况调查，旨在摸清动物园圈养华南虎中钩端螺旋体的感染情况及潜在危险，为华南虎的疾病防控提供一定的基础资料，以促进其种群的保育工作。

1 研究方法

1.1 样本采集

2018 年9 月至2019 年4 月，采集来源于上海、杭州、南京、南昌等11家动物园的119只华南虎血液样本，采集样本数量占全国华南虎饲养种群的47.8%。将华南虎经化学麻醉后静脉采集血液，分别装入含EDTA和促凝剂的血液储存管中，3 000 r/min离心10 min，分离血清，全血及血清均−80℃保存备用。

1.2 检测方法

分别采用PCR (聚合酶链式反应) 和酶联免疫吸附试验(Eenzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 对119 份华南虎样本进行病原学和血清学检测。

1.2.1 PCR检测

全血样本按照钩端螺旋体PCR检测试剂盒(世纪元亨)要求进行DNA提取，PCR反应体系为20µL，其中PCR 反应液16µL，Taq DNA 聚合酶2µL，模板DNA 2 µL， 反 应 在PCR 仪(Jena Biometra TRIO) 上进行，参考以下程序：94℃，3 min；94℃，30 s，60℃，30 s，72℃，30 s，共35 个循环；72℃延伸7 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物，每个样本上样10 µL，凝胶成像系统(Tanon 1600)观察记录检测结果。

1.2.2 ELISA检测

检测前将钩端螺旋体通用型检测试剂盒(荷兰EVL)及待测样本放置室温平衡，阴性对照和阳性对照经蒸馏水溶解后，用稀释液进行30 倍稀释，样本用稀释液进行150倍稀释。将稀释好的样本和阴阳性对照分别加100 µL 至反应板上，均设置两个平行对照，轻轻震荡，封板膜封板，37℃温箱中孵育60 min；将浓缩洗涤液进行200 倍稀释，每孔加入300µL进行洗涤，共洗5次；每孔加HRPO单克隆抗体100µL，封板，37℃孵育60 min；按照上述要求每孔洗涤5 次，等量混匀缓冲液A 和B，每孔加入A液和B液的混合液100µL，室温放置10~15 min；每孔加入50µL 终止液，10 min 内在酶标仪(迈瑞)上应用450 nm进行读数，记录OD值。阳性对照平均值≥0.7，阴性对照平均值≤0.35，实验成立。结果参照试剂盒说明书中的判定标准，用S/P 值(样本与阳性对照的比值)表示，S/P=(样本平均OD 值−阴性对照平均OD 值)/(阳性对照平均OD 值−阴性对照平均OD 值) ，样本S/P 值≥0.33判为阳性，S/P值<0.33则为阴性。

1.3 数据分析

采用非参数统计检验(Chi-square Test) 对不同动物园以及不同性别、年龄华南虎钩端螺旋体的ELISA 检测数据进行分析，其中不同动物园的数据应用Kruskal-Wallis 检验，不同性别和年龄的抗体数据应用Mann-WhitneyU检验，对其在性别、年龄和不同动物园之间感染的差异进行比较。使用SPSS 23.0对抗体检测数据进行分析，显著性水平设定为0.05。

2 结果

2.1 PCR检测结果

119 份华南虎血液样本PCR 扩增，经琼脂糖凝胶电泳，结果显示均为阴性。

2.2 ELISA检测结果

2.2.1 不同动物园华南虎血清样本钩端螺旋体抗体

11家动物园的119份华南虎血清样本钩端螺旋体抗体检测结果显示，阳性样本50 份，阳性率为42.0%，其中苏州动物园钩端螺旋体抗体阳性率为72.7%，杭州野生动物园61.5%，广州动物园阳性率较低为11.1%，不同动物园华南虎血清抗体差异显著(Kruskal-Wallis,χ2=19.851,P=0.002)，郑州及临沂动物园采样量较少，不参与分析。不同动物园钩端螺旋体抗体阳性率及S/P值见表1。

表1 不同动物园华南虎血清样本钩端螺旋体抗体检测结果Table 1 Seroprevalences of antibody to leptospirosis in South China Tiger from different zoos

2.2.2 不同年龄段和不同性别华南虎血清中钩端螺旋体抗体

不同年龄段华南虎血清钩端螺旋体抗体检测结果，23份幼虎，阳性6份，阳性率为26.1%；96份成年虎，阳性44 份，阳性率为45.8%，成年及幼年华南虎对钩端螺旋体的感染差异显著(Mann-WhitneyU,χ2= 9.233,P= 0.006)。不同年龄华南虎钩端螺旋体抗体阳性率及S/P值见表2。

不同性别的华南虎血清钩端螺旋体抗体检测结果，58 份雄性，阳性24 份，阳性率为41.4%；61 份雌性，阳性26 份，阳性率为42.6%，雌、雄个体感染程度差异不显著(Mann-WhitneyU,χ2=0.006,P=0.941)。不同性别华南虎钩端螺旋体抗体阳性率及S/P值见表2。

表2 不同年龄段和不同性别华南虎血清中钩端螺旋体抗体检测结果Table 2 Seroprevalences of antibody to leptospirosis in South China Tiger at different ages and genders

3 讨论

钩端螺旋体作为人畜共患传染病，可感染家养犬猫、啮齿类、流浪猫、圈养华南虎、人类等(Lapointeet al.,2013)，其中鼠类带菌率可达5% ~7% (张振兴和沈永林，2009)，排菌时间长达3 个月乃至终生，我国已发现多种动物能携带不同血清型的钩端螺旋体，包括赤狐(Vulpes vulpes)、浣熊(Procyon lotor) 等，其宿主范围广泛(张振兴和沈永林，2009)。华南虎作为我国特有珍稀物种，目前已野外灭绝。在迁地保护过程中，华南虎的活动、繁殖和食物等都受到影响，与野生状态差异较大，更易受疾病困扰。在钩端螺旋体病的多发地区及季节，应定期开展监测和调查，为华南虎种群的疾病防控工作提供科学依据。

本文对11家动物园的119份华南虎血液样本开展钩端螺旋体病原及血清抗体调查。结果未检出钩端螺旋体的病原核酸，这可能与华南虎的个体差异有关，有可能在一定时期内华南虎感染钩端螺旋体，并很快自愈，因此未检测到病原，但这并不代表华南虎不是钩端螺旋体的易感动物，环境污染或者免疫力低下以及与带菌动物接触等，仍存在感染和暴发的风险。血清学检测发现阳性样本50 份，抗体阳性率为42.02%，由于使用的试剂盒为通用型，未对血清型进行分型，其致病型、致病力等情况还有待进一步研究，但圈养华南虎种群中钩端螺旋体感染普遍存在，还应引起充分重视。

不同地区动物园的华南虎感染钩端螺旋体差异显著(P<0.05)，与以往研究中猫感染钩端螺旋体的情况相似(Mylonakiset al., 2005; Gamageet al.,2011)，可能是饲养条件以及饲养环境的差异。有报道称钩端螺旋体在温、湿度较高的亚热带发病率较高(Gomardet al., 2019)，表明钩端螺旋体可能更适应温暖湿润的环境。本研究中，成年和幼年华南虎均存在感染钩端螺旋体的情况，且S/P差异显著(P< 0.05)，成年华南虎抗体阳性率更高，S/P 值也更高，推测成年虎的活动范围更大，进食量和食物种类更多，更容易接触到被钩端螺旋体污染的环境、水或食物，且成年个体暴露于传播链的时间更长。不同性别华南虎感染钩端螺旋体，S/P 值差异未达到显著水平(P> 0.05)，说明华南虎雌、雄个体对钩端螺旋体易感性无统计学差异。

钩端螺旋体病的防控关键在于切断传染源。环境、食物、水源以及其他易感动物都可能成为传染源，除了华南虎饲养管理中的日常清洁、病兽隔离和及时治疗外，还应对种群以及周边易感犬猫动物开展流行病学调查，及时掌握并切断潜在传播链与传染源。此外，国内动物园针对犬科、猫科动物多进行犬二联、猫三联等疫苗的免疫预防，有条件的情况下可以增加钩端螺旋体多价疫苗的免疫接种，以降低钩端螺旋体在圈养野生动物中的感染传播。

致谢：本研究在采样过程中得到南昌动物园、杭州野生动物园、苏州动物园、洛阳动物园、广州动物园、重庆动物园、梅花山虎园、成都动物园、郑州动物园和临沂动物园等的大力支持，在此表示感谢！