奥曲肽修饰紫杉醇加五味子乙素胶束的处方优化

王 贵，王唯婷，李 双，邬 俊，陈 毅，姜 爽，李学涛，王晓波

（1.大连医科大学 药学院，辽宁 大连 116044；2.中国人民解放军联勤保障部队第967 医院，辽宁 大连 116021）

肿瘤恶性程度高，发病率呈逐年上升趋势，严重危害人类生命健康。常规抗肿瘤药物半衰期短，缺乏靶向性，在治疗肿瘤的同时，也对正常组织造成很大的毒副作用，从而限制了抗肿瘤药物的临床治疗效果。紫杉醇（PTX）是从短叶红豆杉树皮和针叶中产生的三环二萜类高疏水性化合物，它可以通过多途径、多靶点、多通路作用于肿瘤细胞，是一种目前广泛使用的天然抗癌药物[1]。已被FDA 批准用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及卡波西肉瘤。另外，它还可用于治疗食道癌、子宫内膜癌、头颈癌、小细胞和非小细胞肺癌以及艾滋病等疾病。多项研究表明五味子乙素（Sch B）具有多种药理活性，包括抗氧化、抗炎、化疗保护、心脏保护和神经保护作用等，近年来已有报道Sch B 促进Bax 蛋白表达，抑制Bcl-2蛋白表达，并促进肿瘤细胞凋亡[2-3]。Sch B 和 PTX联用可协同治疗，提高抗肿瘤疗效，但 PTX 和 Sch B 均有较多的不良反应，口服利用度低，容易产生耐药，而水溶性差[4]。

为了解决上述问题，本研究用胶束包裹上述两种药物，制备了奥曲肽（OCT）修饰PTX 和Sch B 共载靶向胶束。胶束作为一种新型的纳米药物载体，由于对疏水药物溶解度的显著提高而受到越来越多的学者关注。胶束中由疏水嵌段和亲水嵌段两亲性嵌段聚合物在水中自行组装而成[5]，具有粒径小、靶向性强、载药量大、安全性高同时保持治疗效果及可控释药等优点，其疏水内核可加载难溶性药物，作为提高难溶药物口服吸收的有效途径，在抗肿瘤药物尤其是抗癌药物递送领域有着广泛的应用前景[6]。但是这种纳米药物系统对于肿瘤只能是被动的靶向，而OCT作为一种人工合成的生长抑素类似物，能够对胶束进行表面修饰，使已制备的胶束具有肿瘤特异靶向性。本实验制备了OCT 修饰PTX 和Sch B 胶束，采用星点设计－响应面分析法优化处方，通过纳米级给药系统，使化疗药PTX 和Sch B 更加安全、有效，为进一步研究OCT 修饰PTX 和Sch B 胶束奠定了理论基础。

1 材料

1.1 仪器

DZKW-S-4 型电子恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；RE52CS 型旋转式蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；Agilent C18色谱柱（美国安捷伦科技有限公司）；20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）。

1.2 药品与试剂

Sch B（成都普菲德生物技术有限公司，含量＞98.66%，批号：JOT-10159）；PTX、TPGS1000（大连美伦生物有限公司，纯度＞99%，批号分别为：MB1178、MB2036）；Soluplus（德国巴斯夫公司）；甲醇、乙腈均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 OCT 修饰PTX 与Sch B 胶束的制备

将Soluplus、TPGS1000、Sch B 和PTX 等精密称量配置于圆底烧瓶中，加入适量甲醇溶解，水浴旋转蒸发除去甲醇（40℃），在圆底烧瓶底部形成一层均匀透明的膜，加入5 mL PBS 并在不同水化温度下振摇15 min，将胶束溶液转移至西林瓶中，加入2 mg OCT，放入转子，在磁力搅拌器上搅拌4 h，最后使用注射器吸出并挤压通过0.22 μm 微孔滤膜2 次，即得[7]。

2.2 胶束包封率的测定及色谱条件

2.2.1 PTX 测 定 色 谱 条 件 Agilent C18色 谱 柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈∶甲醇∶水 = 46 ∶19 ∶35；柱温为30℃；流速为1.0 mL/min；检测波长为227 nm[8]。

2.2.2 Sch B 测定色谱条件 Agilent C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇∶水=85 ∶15；柱温为30℃；流速为1.0 mL/min；检测波长为250 nm[9]。

2.2.3 胶束包封率测定 精准吸取OCT 修饰PTX加Sch B 胶束溶液1 mL，加入1 mL 甲醇破乳，以“2.2.1”和“2.2.2”项下条件分别测定OCT 修饰PTX 与Sch B 胶束中PTX 和Sch B 的包封率（E），并用下列方式计算得出：

E（%）=W1/W× 100 %

W1：高效液相法测得的药物含量；

W：药物投放量。

2.3 PTX 含量测定的方法学建立

2.3.1 溶液的制备 （1）PTX 对照品：精密称取PTX 对照品5 mg，甲醇5 mL，制成1 000 μg/mL 的对照品。用甲醇稀释，稀释后浓度为 5、10、20、40、80、160 μg/mL。 （2）PTX 供试品：吸取OCT修饰的PTX 与Sch B 胶束1 mL，加1 mL 甲醇超声处理2 min 破乳，混匀后取上层清液过膜，即得。（3）空白溶液：空白胶束1 mL，按照“2.3.1（2）”项操作得到。

2.3.2 专属性试验 空白胶束、 PTX 供试品、PTX对照品，按“2.2.1”项下条件测定。空白胶束在相应的时间内没有色谱峰出现，见图 1A；PTX 对照品色谱峰的保留时间为6.2 min 左右，见图 1B；PTX 供试品在对应的时间有色谱峰出现，见图1C，表明胶束的膜材对含量的测定无干扰，该方法专属性良好。

图1 PTX 高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatogram of PTX

2.3.3 线性关系考察 依法测定不同浓度的PTX对照品溶液，计算线性回归方程，X和Y分别代表峰面积和质量浓度。得出PTX 的回归方程是Y= 24 842X- 22 691，R2= 0.999 3，说明在7.8125 ～1 000 μg/mL 范围内，线性关系良好。

2.3.4 精密度试验 按“2.2.1”项下条件对PTX标准品溶液进样测定（n= 7），得出峰面积RSD 值为1.5%，表明该仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性试验 在0、2、4、8、12、16、20 h时对PTX 供试品按“2.2.1”项下条件测定，得出峰面积的RSD 为0.29%，说明PTX 供试品在20 h 内稳定性良好。

2.3.6 重复性试验 按“2.2.1”项下条件对PTX供试品进样（n= 7），得出峰面积RSD 值为0.57%，表明方法的重复性良好。

2.3.7 加样回收试验 吸取空白纳米胶束2 mL，于2 mL 容量瓶中，加入等体积的PTX 对照品混合，滤液按“2.2.1”项下条件测定，算出PTX 的平均回收率为（99.56 ± 0.15）% （RSD = 0.51%，n＝3）。

2.4 Sch B 含量测定的方法学建立

2.4.1 溶液的制备 Sch B 对照品、Sch B 供试品、空白胶束按照“2.3.1”项下操作步骤制备。

2.4.2 专属性试验 空白胶束、 Sch B 供试品、Sch B 对照品，按“2.2.2”项条件进样，Sch B 对照品的保留时间是5.5 min 左右，见图2B；Sch B 供试品在与Sch B 对照品对应的时间段有色谱峰出现，见图2C，结果说明专属性良好 。

图2 Sch B 高效液相色谱图Fig.2 High performance liquid chromatogram of Sch B

2.4.3 线性关系考察 依法测定不同浓度的Sch B对照品溶液，并计算回归方程。结果Sch B 的回归方程为Y= 17 882X+ 284 826，R2= 0.999 2，结果说明在7.812 5 ～ 1 000 μg/mL 范围内，线性关系良好。2.4.4 精密度试验 按“2.2.2”项下条件对Sch B标准品溶液进样测定（n= 7），得出峰面积RSD 值为0.12 %，表明该仪器精密度良好。

2.4.5 稳定性试验 按“2.2.2”项下条件和“2.3.5”项下方法测定Sch B 供试品的稳定性，得出峰面积RSD为0.35%。说明Sch B供试品在20 h内稳定性良好。

2.4.6 重复性试验 按“2.2.2”项下条件对Sch B供试品进样 （n= 7），峰面积RSD 值为0.44%，说明该方法重复性良好。

2.4.7 加样回收试验 按“2.2.2”项下条件和“2.3.7”项下方法测定Sch B 的回收率，结果Sch B 的平均回收率为（95.1 ± 0.9）%（RSD ＝0.63%，n＝3）。

2.5 处方优化

2.5.1 处方优化 以单因素考察结果，选择 3 个在OCT 修饰PTX 与Sch B 胶束制备过程中影响较大的因素：Soluplus ∶PTX（A）、Soluplus ∶TPGS1000（B）和水化时间t （C）。确定3 个因素的优选范围为：A：100 ∶1 ～ 200 ∶1，B：2 ∶1 ～ 10 ∶1，C：5 ～15 min，因素编码水平见表 1。以OCT 修饰PTX 与Sch B 胶束中PTX 的平均包封率（Y）为响应值，用响应面法进行分析，见表2。

表1 胶束响应面试验因素编码Tab.1 Code of micellar response surface test factors

表2 Box-Behnken 实验设计方案与结果Tab.2 Scheme and results of Box-Behnken experimental design

使用 Design-Expert.V8.0.6.1 统计学软件进行回归分析，得到二次多项回归方程如下：Y= 91.76 +32.24A- 4.18B+ 5.45C+ 8.51AB- 3.79AC+ 0.22BC-30.47A2- 1.92B2- 2.99C2，方差分析见表3。方差决定系数R2= 0.991 4，校正决定系数Radj= 0.980 4，表明此回归模型的拟合度较好；F= 69.73，P< 0.000 1，表明回归方程具有统计学差异。失拟项F= 4.25，P= 0.097 9 ＞ 0.05，表明模型拟合程度较好，可用于优化OCT 修饰PTX 与Sch B 胶束处方。另外，一次项A、B、C、二次项A2和两两交互项AB对于回归模型具有显著性影响，而三个单因素指标对回归模型的影响程度为A＞C＞B。

表3 方差分析表Tab.3 Analysis of variance

根据分析结果，考察等高线和响应曲面的形状，结果见图3，3 个因素中C对Y值的影响不大，A与B对Y值则影响显著。上述交互因素中A与B的效应面较陡峭，等高线呈椭圆形，A与C的效应面形状更加较陡，等高线也呈椭圆形，说明A与B、A与C的交互作用明显，但是B与C的效应面与前两者效应面相比相对平缓，等高线不呈椭圆形，则B与C的交互作用不明显。通过软件分析，预测包封率最大时最佳的处方为 Soluplus ∶PTX = 150 ∶1，Soluplus ∶TPGS1000 = 6 ∶1，水化时间：13 min，在此条件下，OCT 修饰PTX 与Sch B 胶束中PTX 的平均包封率值最大，为93.96%。结合胶束的特性和制备经验，最终处方为Soluplus 60 mg、TPGS1000 6 mg、PTX 0.3 mg、Sch B1.5 mg、OCT 2 mg，处方量为5 mL。

图3 各因素对OCT 修饰的PTX 与Sch B 胶束平均包封率影响的等高线图和效应面图Fig.3 Contour map and surface diagram of the effect of three factors on the average entrapment efficiency of octreotide modified PTX and Sch B micelles

2.5.2 处方验证

按“2.5.1”项下筛选最优处方制备OCT 修饰的PTX 与Sch B 胶束，按“2.2.1”项下条件测定PTX包封率。结果OCT 修饰的PTX 与Sch B 胶束中PTX平均包封率为 （91.63 ± 2.94） %（RSD = 2.87%，n=3）。样品组的测量值与预测值（93.69%）比较接近，二者偏差的平均值为2.71，显示模型具有良好预测性。

3 讨论

PTX 是一种靶向微管蛋白的小分子细胞毒素，是公认的世界上最有效天然抗癌药物，它能破坏癌细胞微管蛋白的平衡，阻滞癌细胞在G2/M 期，从而抑制癌细胞的增殖[10]，而且能够诱导肿瘤坏死因子相关基因表达，加强干扰素释放[11]。有研究表明PTX 胶束的作用机制是通过巨胞饮内吞及溶酶体聚集使药物作用于肿瘤细胞，促进肿瘤细胞凋亡[12]。PTX 的其它纳米给药系统也受到很多研究者的追捧，近年来研究比较多的有紫杉醇脂质体、紫杉醇壳聚糖纳米粒、紫杉醇纳米乳制剂[13]等，表面修饰靶向肽，并且和其它药物共载，以达到增加靶向性和药物疗效，降低毒副作用。临床上应用较多的是PTX注射剂、白蛋白型PTX 和PTX 脂质体，白蛋白和脂质体作为纳米材料具有良好的生物相容性且毒性较低，是目前进入临床试验的纳米递送药物载体。虽然PTX 化疗药的疗效已得到多项报道证实，并广泛应用于癌症、真菌治疗和病毒感染等方面[14]，但治疗期间易引起不良反应，对肿瘤细胞缺乏靶向性，且水溶性较差[4]。临床上传统的PTX 注射剂易导致过敏反应发生，影响抗肿瘤效应。Sch B 常作为调节剂被用于化疗中，能够有效抑制肿瘤转移和拟态血管的形成[15]。本实验选用TPGS1000 作为胶束膜材可以明显改善药物包封效率，增加纳米颗粒的细胞摄取，并且有研究表明TPGS1000 能通过抑制P-gp 表达从而防止癌细胞产生多药耐药性[16-17]。

星点设计－响应面法能够考察多个因素多个水平对因变量的影响，在药物处方优选上有显著作用，具有精确度高、试验次数少的优点[18]。响应面图能够表达OCT 修饰PTX 加Sch B 胶束中3 个因素的趋势，由响应面图可见，Soluplus ∶PTX 质量比与Soluplus ∶TPGS1000 的膜材比对OCT 修饰PTX 与Sch B 胶束包封率的影响程度大于水化时间，是OCT修饰PTX 与Sch B 胶束制备的关键因素。因此，在聚合胶束的制备过程中，精密称取PTX、TPGS1000与Soluplus 相当关键。

4 结论

本实验成功将OCT 修饰在胶束表面并包载了PTX 与Sch B，构建了OCT 修饰PTX 与Sch B 胶束；采用了星点设计-响应面法优化OCT 修饰PTX 与Sch B 胶束的处方，确定OCT 修饰PTX 与Sch B 胶束中PTX 与Sch B 的含量测定方法，并对测定方法进行考察，有利于提高和控制药品质量，使制备工艺安全稳定。