响应面法优化黄秋葵花总黄酮提取工艺研究

王文婷，张 妍，李海明，袁 翔，肖慧敏

(宿州学院 生物与食品工程学院，安徽 宿州 234000)

0 引言

秋葵属锦葵科，双子叶植物，是一种一年生(热带多年生)的草本植物，是菜药两用植物，营养价值很高，并且具有一定的保健功能．研究表明，黄秋葵花中黄酮类化合物的含量是大豆叶子的300倍[1]．黄酮类化合物可以被人体很快吸收，吸收以后通过人体的脑血屏障进入脂肪组织，可以防止人类血管动脉粥样硬化从而保护血管，也可以疏通体内血液循环、提高视力、活跃大脑细胞以及人体内其他脏器细胞等，同时还具有抵抗人体衰老、抵抗疲劳、降低血脂血压、防止脂肪氧化以及治疗烧伤烫伤等功能[2-4]．其中，抗衰老的作用机制主要和黄酮类化合物的抗氧化活性有关．因为大多数黄酮类化合物中的羟基和羰基可以阻止体内自由基的产生或清除体内自由基，从而避免体内的氧化损伤，具有极强的抗氧化活性[5]．

目前，对黄秋葵花中总黄酮的提取方法和它的抗氧化活性的研究报道较少．黄酮类化合物的提取方法主要有碱性水或碱性稀醇提取法、水提法、有机溶剂提取法等，但这些方法往往存在试剂消耗量大、耗时长等问题[6-7]．因此，本试验采用超声波提取法探究黄秋葵花总黄酮的提取工艺，为提高黄秋葵花的综合开发提供一定的理论依据．

1 材料与方法

1.1 主要原料与试剂

黄秋葵花(亳州市汇东生物科技有限公司)；芦丁标准品(上海创赛科技有限公司)；NaNO2、NaOH(南京化学试剂股份有限公司)；CH3CH2OH(安徽安特食品股份有限公司)．

1.2 主要仪器和设备

电子分析天平(济南欧莱博科学仪器有限公司，PRACTUM124-1CN)；电热恒温鼓风干燥箱(上海丙林电子科技有限公司，DHG-3S)；台式多用途高速离心机(广州吉迪仪器有限公司，JIDI-16D)；高速摇摆式粉碎机(浙江超群机械设备有限公司，CQF-4D)；数控超声波仪(广州昊昕科技有限公司，KQ5200DB)；紫外可见分光光度计(聚创华业仪器有限公司，UV-759)．

1.3 试验方法

1.3.1 标准曲线的制作

参考董丹等[6]的方法，测定并制作芦丁标准曲线：y=6.6619x-0.0161，R2=0.9991．

1.3.2 黄秋葵花总黄酮的提取

干燥的黄秋葵花粉碎后过80目筛，称取适量黄秋葵花粉末于带塞的锥形瓶中，加入一定浓度的乙醇溶液，混合摇匀后置于超声波仪中，在一定温度下超声提取一定时间，提取后转移至离心管，以5 000 r/min离心10 min，最后取上清液，备用[8-10]．

1.3.3 黄秋葵花总黄酮的测定

采用硝酸化铝法，在1.3.2提取出的上清液中加5%的NaNO2溶液，混匀，5 min后加入10%的Al(NO3)3溶液，同样混匀，6 min后加4%的NaOH溶液，最后用40%的乙醇溶液定容，放置15 min后测定其吸光度值．再由1.3.1中的标准曲线计算出黄秋葵花样品溶液中总黄酮的质量浓度，由式(1)计算出黄秋葵花总黄酮的提取率[10-11]．

(1)

式中：c为黄秋葵花样品溶液中总黄酮的质量浓度，mg/mL；V为黄秋葵花总黄酮提取液的定容体积，mL；d为黄秋葵花样品溶液的稀释倍数；m为黄秋葵花样品质量，g．

1.3.4 黄秋葵花总黄酮提取单因素试验

(1)乙醇浓度对提取黄秋葵花总黄酮的影响

准确称取1.0000 g黄秋葵花粉末，分别加20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液160 mL，然后在超声波50 ℃温度下提取30 min．按照1.3.2和1.3.3中的方法得到不同乙醇浓度下黄秋葵花总黄酮的提取率，研究提取过程中不同的乙醇浓度对总黄酮提取率的影响．

(2)超声温度对提取黄秋葵花总黄酮的影响

准确称取1.0000 g黄秋葵花粉末，加入160 mL 50%的乙醇溶液，用30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃超声波分别提取30 min．按照1.3.2和1.3.3中的方法得到不同温度下黄秋葵花总黄酮的提取率，分析提取过程中不同的超声温度对总黄酮提取率的影响．

(3)超声时间对提取黄秋葵花总黄酮的影响

准确称取1.0000 g黄秋葵花粉末，加入50%的乙醇溶液160 mL，在60 ℃下分别用超声波提取10 min、20 min、30 min、40 mim、50 min、60 min．按照1.3.2和1.3.3中的方法,在不同时间下提取黄秋葵花总黄酮，绘制超声时间-提取率曲线，探究提取过程中不同的超声时间对总黄酮提取率的影响．

(4)料液比对提取黄秋葵花总黄酮的影响

准确称取1.0000 g黄秋葵花粉末，在提取时间30 min、超声温度60 ℃的条件下，加入一定量的50%乙醇溶液，将料液比(g/mL)设定为1∶120、1∶140、1∶160、1∶180、1∶200、1∶220，提取黄秋葵花中的总黄酮．按照1.3.2和1.3.3中的方法，得到不同料液比下黄秋葵花总黄酮的提取率，考察提取过程中不同的料液比对总黄酮提取率的影响．

1.3.5 Box-Behnken试验设计

根据超声波提取黄秋葵花总黄酮的单因素试验结果，设计四因素三水平表如表1，进行黄酮提取的响应面优化试验.

表1 四因素三水平试验设计

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同乙醇浓度对黄秋葵花总黄酮提取率的影响

不同乙醇浓度对黄秋葵花总黄酮提取率的影响如图1所示.随着超声波提取黄秋葵花总黄酮时的乙醇浓度的增加，提取率先增加后减少，最高为8.54%．这可能是因为随着提取时乙醇浓度的增加，溶质溶出量趋向缓慢饱和，乙醇浓度越大，其极性相对降低，对提取物的作用也越小，且会有其他物质溶出[12]．因此，黄秋葵花总黄酮提取时应选取的最佳乙醇浓度为50%．

图1 乙醇浓度对黄秋葵花总黄酮提取率的影响

2.1.2 不同超声温度对黄秋葵花总黄酮提取率的影响

不同超声温度对黄秋葵花总黄酮提取率的影响如图2所示.随着超声温度的升高，黄秋葵花总黄酮的提取率先增加后略微下降，在60 ℃达到最高值，为7.13%．可能是因为开始时温度升高能够加快黄酮类物质的溶出，但温度太高，会破坏黄酮的稳定性[13]．所以，黄秋葵花总黄酮提取时应选取的最佳超声温度为60 ℃．

2.1.3 不同超声时间对黄秋葵花总黄酮提取率的影响

不同超声时间对黄秋葵花总黄酮提取率的影响如图3所示.随着超声时间的增加，黄秋葵花总黄酮的提取率先上升后下降，30 min时达到最高提取率，为7.28%．

图2 超声温度对黄秋葵花总黄酮提取率的影响

图3 超声时间对黄秋葵花总黄酮提取率的影响

因为随着超声时间的增加，热效应和机械效应也在逐渐加强，从而破坏提取出的黄秋葵花总黄酮的结构，随之其提取率有所下降[9]．所以，黄秋葵花总黄酮提取时应选取的最佳超声时间为30 min．

2.1.4 不同料液比对黄秋葵花总黄酮提取率的影响

不同料液比对黄秋葵花总黄酮提取率的影响如图4所示.随着提取剂的增加，黄秋葵花总黄酮的提取率呈先增加后减少的趋势，料液比(g/mL)为1∶180时达到最高值8.72%．提取剂量过大造成提取率有所下降，一方面由于提取剂与原料的比例越大，浓度差就越大，导致物质的运输过程越快；另一方面，比例的升高也会增加一些脂溶性物质和醇溶性杂质的溶出，从而影响总黄酮的浸出，提取率下降[14]．所以，黄秋葵花总黄酮提取时应选取的最佳料液比(g/mL)为1∶180．

图4 料液比对黄秋葵花总黄酮提取率的影响

2.2 响应面法优化黄秋葵花总黄酮提取工艺的 试验结果

2.2.1 响应面试验结果及其显著性分析

响应面试验结果如表2.根据表2的结果，由响应面软件(Design Expert10)分析得到方差分析结果，见表3．其中，二次多项式回归方程为：

总黄酮提取率=10.76-0.15A-0.12B+ 0.13C+0.17D+0.24AB+0.22AC+ 0.059AD-0.081BC-0.015BD-0.10CD- 0.51A2-0.16B2-0.56C2-0.42D2．

由表3可知，模型的P值小于0.000 1，说明模型有显著性差异和统计学意义，且失拟项P=0.093 0，大于0.05，失拟项不显著，说明试验误差小[10,12]．

表2 响应面法优化试验设计结果

另外，从表3中看出，A(乙醇浓度)、B(超声温度)、C(超声时间)、D(料液比)对黄秋葵花总黄酮提取率影响都极显著．AB(乙醇浓度与超声温度)、AC(乙醇浓度与超声时间)的交互作用影响极显著，CD(超声时间与料液比)的交互作用明显，其他各两因素间的交互作用不明显．

2.2.2 响应面图分析

利用响应面软件得出各因素交互作用对黄秋葵花总黄酮提取率影响的曲面图如图5．其中，曲面图越陡，图形越接近椭圆，说明交互作用越明显，最小椭圆的中心点为曲面图的最高点[8-9]．由图5可见，不同因素交互作用对黄秋葵花总黄酮提取率的影响程度不同，其中，乙醇浓度与超声温度、乙醇浓度与超声时间、超声时间与料液比的交互作用均比较明显，这与方差分析结果一致．

表3 方差分析结果

根据响应面预测分析，确定了黄秋葵花总黄酮的最佳提取工艺：A(乙醇浓度)为47.561%、B(超声温度)为53.921℃、C(超声时间)为30.417 min、D(料液比)为1∶183.834，黄秋葵花总黄酮提取率为10.839%．

根据实际，为了便于操作，修正最佳工艺，即A(乙醇浓度)为48%、B(超声温度)为54℃、C(超声时间)为30 min、D(料液比)为1∶184，进行平行验证试验后，最终提取率为10.953%，和预测基本一致，所以该响应面的优化结果具有可行性．

图5 不同因素交互作用对总黄酮提取率影响的响应面图

3 结论

在单因素试验基础上，采用响应面法优化了黄秋葵花总黄酮的提取工艺，得到最佳工艺参数：乙醇浓度48%、超声温度54℃、超声时间30 min、料液比(g/mL)1∶184，最佳工艺下黄秋葵花总黄酮提取率可达10.953%．黄秋葵花的花期长、产量大，但它的枯萎速度也很快，经常被当作垃圾焚烧处理，这样不但造成浪费资源，且污染环境．如果可以利用黄秋葵花提取其中的黄酮物质，不仅能够废物利用，还可为天然黄酮的开发与应用提供参考．