干旱胁迫下红、绿茎马齿苋幼苗的生理生化特性比较

吴 曼，金 苇，李 影，张文慈，向文珍，周 讯，石晓雨，刘玉贞，付 珊, 2, 3,5，朱旺新，陈 亮, 2, 3,5

(1.湖北师范大学 生命科学学院，湖北 黄石 435000；2.特色野菜良种繁育与综合利用湖北省工程技术研究中心，湖北 黄石 435000；3.食用野生植物资源保育与利用湖北省重点实验室，湖北 黄石 435000；4.湖北省黄冈市英山县自然资源和规划局，湖北 黄冈 438799；5.湖泊生物多样性与环境保护黄石市重点实验室(湖北师范大学)，湖北 黄石 435000)

0 引言

干旱是自然界中主要的非生物胁迫之一，也是影响植物生长发育、产量以及分布的重要因素之一[1]。随着全球变暖，干旱造成的危害日益严重。因此，研究植物的抗旱性以及如何提高植物的抗旱能力成为研究者们的重要工作之一。

马齿苋(PortulacaoleraceaL.)又称马苋、豚耳等，是马齿苋科马齿苋属的一年生肉质草本植物[2]，因其形似“马齿”，味类“苋菜”而有马齿苋之名。马齿苋分布广泛，遍及温带和热带的大部分地区，在我国大多数省份都有分布，常见生长于菜地、荒土以及农田中。马齿苋富含蛋白质、钙、磷、铁、胡萝卜素、维生素C等，是深受人们喜爱的食用野菜之一。马齿苋也具有重要的药用价值，如清热利湿，散血消肿，凉血解毒[3]，抗虫杀菌[4]等功效。此外，马齿苋因其叶片肥嫩多汁、营养丰富，而茎秆纤维不多，使其成为备受畜牧业青睐的良好饲料。总之，马齿苋是集食用价值、药用价值、畜牧价值于一身的植物，目前人工栽培马齿苋面积逐年增多，其利用前景可观。野生马齿苋常见有三个品种，宽叶苋、窄叶苋、观赏苋[5]，本实验根据马齿苋采样、调查得到，野生的马齿苋在自然状态下存在红杆、绿杆两种不同生态功能型(红茎马齿苋生境干旱，绿茎马齿苋生境相对潮湿)。目前学界对马齿苋的形态结构、化学成分等方面的研究比较多，但针对马齿苋在干旱胁迫环境下的生理指标的研究文献还比较少，特别是对红茎、绿茎两种生态型马齿苋在干旱胁迫环境下的幼苗生长状况以及生理指标等方面的研究更是鲜见报道。

因此，本研究以两种生态型的红、绿茎马齿苋为材料，通过人为控制浇水，对其盆栽幼苗进行正常浇水(对照组)、干旱五天、干旱十天的胁迫处理，结束胁迫后测定红、绿茎马齿苋的生长指标以及生理指标，从生理层面对其抗旱机制进行探索，初步分析其抗逆机制，以期加速马齿苋耐旱品种的选育，有效开发和利用马齿苋资源、促进马齿苋产业化利用、建设好我省高山地区(四大片区)特色蔬菜产业，以及加快精准扶贫提供重要的理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料及培养

红茎、绿茎马齿苋种子于2018～2019年采集于湖北师范大学校园内，在实验室内培养后进行后续实验。

挑取形态完整、大小相差无几的健康的红茎、绿茎马齿苋种子，分别浸泡于水中过夜，再将种子置于阴凉通风、干燥黑暗处晾干积水，4 h后取适量种子均匀平铺于有四层纱布、双层滤纸铺垫的培养皿中，并在培养皿上做好标记，浇水适量以浸润种子为宜。将种子置于25 ℃人工气候培养箱中培养，光照时间为12 h·d-1，湿度为90%，等待发芽。

将发芽后的红茎、绿茎马齿苋幼苗分别移栽入高7.3 cm，上口径7 cm，下口径5 cm的装有无菌生长基质(土壤∶蛭石=4∶1)的小盆中，种植密度为每小盆9株幼苗。将幼苗转入25℃温室中培养，每日每小盆浇水0.03 L，以保持土壤湿润为宜。待幼苗长出两对真叶时对红茎、绿茎幼苗分别进行分盆，以保障幼苗能获得充足的生长空间，此时的种植密度为每小盆4株幼苗，并分别对马齿苋红茎植株和绿茎植株展开正常浇水(对照组，每天浇水15 mL)、干旱5 d、干旱10 d的胁迫处理。干旱胁迫处理20 d后，分别选取长势一致的红茎、绿茎马齿苋各个干旱胁迫梯度的叶片，测量各项生理指标。

1.2 主要试剂与仪器设备

1.2.1 主要仪器设备

1)电子天平(AB204-N型，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)

2)优普超纯水机(UPH-IV-60L型，成都超纯水有限科技公司)

3)烘箱(WMK-02型，武汉电控仪器厂)

4)紫外-可见光分光光度计(UV2102PC型，龙尼柯上海仪器有限公司)

5)恒温水浴锅(HH-4型，金坛市精达仪器制造厂)

6)光照培养箱(GX2-2808M型，宁波杨辉仪器有限公司)

7)其它：试管(带塞)，烧杯，玻棒，玻璃漏斗，量筒，滤纸，移液枪，试管架，研钵、培养皿、胶头滴管等。

1.2.2 主要试剂与溶液

1)浓硫酸(分析纯，开封东大化工有限公司试剂厂)

2)无水乙醇(分析纯，上海试剂三厂)

3)蒽酮试剂(分析纯，上海化学试剂采购供应五联化工厂)

4)活性炭(天津市恒兴化学试剂制造有限公司)

5)葡萄糖(分析纯，上海试剂三厂)

6)磺基水杨酸(指示剂，湘中精细化学品厂)

7)茚三酮(分析纯，上海试剂三厂)

8)磷酸(分析纯，天津市天力化学试剂有限公司)

9)甲苯(分析纯，上海试剂三厂)

10)冰乙酸(分析纯，上海试剂三厂)

11)脯氨酸(上海易蒙斯化工科技有限公司)

12)盐酸(分析纯，武汉市江北化学试剂有限责任公司)

13)氢氧化钠(分析纯，上海试剂三厂)

14)亚硝酸钠(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)

15)丙酮(分析纯，天津市凯通化学试剂有限公司)

16)石英砂(分析纯，上海试剂三厂)

17)碳酸钙(化学纯，广东汕头西陇化工厂)

18)二甲苯(分析纯，shanghai Macklin Biochemical Co, Ltd.)

1.3 生长指标的测定

株高的测量：用直尺分别测量干旱胁迫处理20 d后的红茎和绿茎马齿苋幼苗的植株高度(即由第一个根毛最末端的根尖至茎顶端的长度)，并记录数据，每组实验3～5个重复。

植株茎、叶变化：待马齿苋干旱胁迫处理20 d后，分别记录马齿苋红茎、绿茎植株三个干旱胁迫梯度之间茎、叶形态的变化与差异。

1.4 生理指标的测定

取干旱胁迫处理20 d后的红茎和绿茎马齿苋幼苗，测定各项生理指标。

1.4.1 可溶性糖含量测定 可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法[6]。分别称取红、绿茎马齿苋粉末50 mg，每组设置3个重复，利用80%乙醇在80℃水浴浸提40 min，用活性炭80℃脱色30 min，加入蒽酮试剂，在625 nm波长下测吸光值。将结果与标准曲线对比，根据公式求出红、绿茎马齿苋中可溶性总糖的含量：

式中C表示可溶性糖含量(%)，A表示从标曲中查的糖量(μg)，VT表示样品提取液总体积(mL)，N表示稀释倍数，V1表示显色时取样量(mL)，W表示样品重(g).

1.4.2 MDA含量测定 丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量测定，采用硫代巴比妥酸比色法[7]。取0.5 g新鲜红、绿茎马齿苋剪碎后加入5 mL 10%TCA进行研磨提取，离心后取上清，为样品提取液。取2 mL样品提取液(对照组加2 mL蒸馏水)加入2 mL 0.6%TBA溶液，摇匀，沸水浴15 min后取出并迅速冷却。取上清液测定532 nm、600 nm和450 nm波长下的OD值。根据公式求出红、绿茎马齿苋中MDA的浓度：

C1=6.45(D532-D600)-0.56D450

C2=C1×V/W

式中C1表示植物样品提取液中MDA的浓度(μmol·L-1)，D表示该波长下的吸光度值，C2表示MDA含量(μmol·g-1)，V表示提取液体积(mL)，W表示植物组织鲜重(g)。

1.4.3 花青素含量测定 取0.5 g新鲜红、绿茎马齿苋剪碎，加入0.1 mol·L-1HCl 10 mL(HCl用量可视花青素含量而增减)提取，用称量纸封住杯口。置于32℃恒温箱中，至少浸渍4h.浸渍完成后过滤。取滤液，在波长530 nm下、以0.1 mol·L-1HCl为空白对照读取OD值。当OD值为0.1时的花青素浓度称为一个单位，以比较花青素的相对含量。将测得的OD值乘以10，则可以用来表示花青素的相对浓度单位。

1.4.4 POD活性测定 过氧化物酶POD(Peroxidase，POD)活性测定，采用愈创木酚法[8]。取0.5 g新鲜红、绿茎马齿苋剪碎后加入20 mmol·L-1KH2PO4溶液进行研磨提取，离心后取上清，最后定容至4 mL，为酶提取液。取0.5 mL酶提取液(对照组加0.5 mL 20 mmol·L-1KH2PO4)加入3 mL反应混合液(每100 mL反应混合液由100 mL pH=6的磷酸缓冲液、56 μL 0.25%愈创木酚和38 μL 30%H2O2组成)迅速震荡摇匀，同时，立即开启秒表，此时读取的OD470nm值为0 s时的OD值。每30 s读取一次OD值，读取5 min内的OD值。每分钟的OD变化快慢可以表示酶的活性大小度量，可用每分钟OD值变化0.01作为一个过氧化物酶活性单位(U)。根据公式求出红、绿茎马齿苋中POD活性：

F=ΔA470×VT/(W×VS×t×0.01)

式中F表示过氧化物酶活性(U·g-1·min-1)，ΔA470表示反应时间内OD470nm的变化量，W表示植物鲜重(g)，VT表示提取酶液总体积(mL)，VS表示测定时用取酶液体积(mL)，t表示反应时间(min).

1.5 数据统计与分析

利用Microsoft Excel 2010对上述红茎、绿茎马齿苋的生长指标、生理指标相关数据展开数据分析，并使用IBM SPSS Statistics 25软件进行差异显著性检验(P<0.05)。利用Microsoft Excel 2010软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对红、绿茎马齿苋幼苗生长指标的影响

此外，随着干旱胁迫程度的加强，红、绿茎马齿苋幼苗枝条节间变短，茎秆变细，叶面积减少，叶片颜色发暗，叶缘变红，叶片皱缩合拢，叶数量增加缓慢(图1)。由图2可知，随着干旱胁迫程度的逐渐增加，红、绿茎马齿苋株高均呈逐渐下降的趋势。在干旱10 d处理下，红、绿茎马齿苋株高分别为8.7cm、6.9cm，相较于对照组有显著性差异(P<0.05)。由此说明，干旱胁迫对红、绿茎马齿苋株高的生长均有抑制作用，且对绿茎马齿苋的抑制作用强于红茎马齿苋。

图1 干旱胁迫下红、绿茎马齿苋的表型图，其中A图为干旱胁迫下绿茎马齿苋表型图；B图为干旱胁迫下红茎马齿苋表型图。

2.2 干旱胁迫对红、绿茎马齿苋幼苗生理指标的影响

图2 干旱胁迫下红、绿茎马齿苋幼苗的株高

2.2.1 干旱胁迫对红、绿茎马齿苋幼苗可溶性糖含量的影响 参与渗透调节、提供营养物质是可溶性糖在植物受到干旱胁迫时承担的重要使命。植物的叶片中含有较高含量的可溶性糖，不仅可以作为植物的营养物质还可以增强植物对外界胁迫的响应。由图3可以看出，随着干旱胁迫程度的加强，红、绿茎马齿苋中可溶性糖含量均呈依次增加的趋势。在不同干旱胁迫程度下，绿茎中可溶性糖含量高于红茎，但是无显著性差异。在干旱10 d处理下，可溶性糖含量达到最多，红、绿茎分别为16.78×10-6mg·mg-1、18.54×10-6mg·mg-1，相较于对照组有显著性差异(P<0.05)(图3)。

2.2.2 干旱胁迫对红、绿茎马齿苋幼苗MDA含量的影响 植物体内MDA含量的高低，是衡量植物处于干旱胁迫的生长环境下而引发植物细胞膜脂过氧化作用的强度的重要指标。因此，对马齿苋红茎、绿茎的MDA含量进行测量可以体现出两种生态型马齿苋(绿茎、红茎)的抗旱能力。实验结果显示，随着干旱胁迫程度的加强，红、绿茎马齿苋中MDA含量均呈逐渐上升的趋势，且绿茎马齿苋中的含量高于红茎。在干旱10 d胁迫处理下，丙二醛含量达到最多，红、绿茎分别为1.38×10-6mol·g-1FW、1.62×10-6mol·g-1FW，相较对照组有显著性差异(P<0.05)(图4)。

图3 干旱胁迫下红、绿茎马齿苋幼苗可溶性糖的含量 图4 干旱胁迫下红、绿茎马齿苋幼苗的MDA含量

2.2.3 干旱胁迫对红、绿茎马齿苋幼苗花青素含量影响 花青素是植物中分布广泛的一类多酚类色素，可以保护植物免受多种非生物以及生物胁迫。由图5可知，随着干旱胁迫程度的加强，红、绿茎马齿苋中花青素含量均呈逐渐上升的趋势，说明干旱促进了花青素的合成。并且，在不同的干旱胁迫程度下，红茎中花青素含量显著性高于绿茎，表明红茎马齿苋相较于绿茎具有更强的耐旱作用。此外，在干旱10 d胁迫处理下，花青素含量达最高值，红、绿茎马齿苋的含量分别为5.2、4.23(相对含量)，相较于对照组有显著性差异(P<0.05)。

图5 干旱胁迫下红、绿茎马齿苋幼苗花青素的含量

2.2.4 干旱胁迫对红、绿茎马齿苋幼苗POD活性的影响 POD活性是一种广泛存在于植物体中的活性酶，它与呼吸作用，光合作用及生长素的氧化等都有密切联系。由图6可知，随着干旱胁迫程度的加强，红、绿茎马齿苋中POD活性均呈逐渐上升的趋势，且红茎中POD活性强于绿茎。在干旱10 d处理下，POD活性达到最大，红、绿茎分别为560 U·min-1·g-1FW、480 U·min-1·g-1FW，相较于对照组有显著性差异(P<0.05)。由此可见，干旱胁迫的加剧可以使红、绿茎马齿苋中POD活性增强。

图6 干旱胁迫下红、绿茎马齿苋幼苗POD的活性

3 讨论

干旱是限制植物生长和发育的关键因子之一[9]。植物在遭受到干旱胁迫时，胁迫强度的增加和胁迫时间的延长都会对植株造成严重的损害[10]。 许多研究表明，干旱胁迫下植物经常表现为植株生长减弱，最大叶面积、比叶面积(单位重量的叶面积)、叶面积的生长率、叶片数量和生物产量都显著降低[11，12]。如唐健民等[13]研究发现，随着干旱胁迫的程度不断加剧东兴金花茶幼苗会叶片萎蔫、打卷，同时光合速率和蒸腾速率下降，甚至死亡；丁雪丹等[14]研究发现干旱胁迫对不同花境植物的叶片数增量均有抑制作用，叶片数量受干旱影响均呈下降趋势，不同花境植物随干旱胁迫的增强叶面积呈降低趋势。Michelena和Boyer[15]研究认为，在干旱胁迫环境下植物形态发生改变可能与细胞壁的硬化响应有关。在干旱条件下细胞壁的硬化限制了植物叶面积的扩大，使得植物的蒸腾失水显著降低，提高植株的存活时间。在本研究中发现，在干旱胁迫下，红茎、绿茎马齿苋生长受到抑制，株高降低、叶片皱缩、叶面积缩小，并且随着干旱胁迫程度的增加，抑制强度增加(图1)。此外，干旱胁迫对绿茎株高生长的抑制作用强于红茎，说明红茎马齿苋相较于绿茎具有更强的耐旱能力(图2)。

研究表明遭受逆境胁迫时，植物体内会积累大量的渗透调节物质，从而降低细胞的水势，减轻植株受到的伤害[16，17]。可溶性糖是植物体内渗透调节最重要的物质之一，其在处于干旱胁迫过程中的植物体内的变化能在一定程度上反映植株对不良环境的适应能力[18]。高昆[19]等人的研究结果表明，干旱胁迫程度越强，锦灯笼(PhysalisalkengiL.var.franchetii(Mast.) Makino)幼苗中可溶性糖的含量就越高。而在本研究中，两种生态型马齿苋幼苗中的可溶性糖含量在两种干旱胁迫梯度随干旱胁迫程度的增强逐渐增加(图3)，说明这两种生境的马齿苋对干旱均具有一定的耐受性。但是，在同一干旱程度下，绿茎马齿苋中可溶性糖含量略高于红茎马齿苋，表明二者对干旱的耐受机制存在一定的差异。虽然红茎马齿苋对干旱的耐受能力强于绿茎(图3～6)，但是为了应对干旱胁迫，绿茎马齿苋也通过增加过多的可溶性糖含量来提高其生存率。

在干旱、低温等不良环境胁迫时，植物体内常常发生膜脂过氧化作用。膜脂过氧化的产物O2-、-OH和H2O2自由基，会破坏膜系统，导致植物伤害[20]。POD能够通过在氧化相应基质(如酚类化合物)时清除低浓度的H2O2，将H2O2还原成H2O，以消除细胞内的H2O2[21]，维持细胞正常生理功能。且干旱条件下，POD的调节能力越大，表明作物抗旱性越强[22]。在植物体内，MDA也是脂质过氧化的主要产物之一，它的积累是活性氧毒害作用的表现，因此其含量可以反映出植物遭受逆境胁迫的伤害程度[23]。高昆、王佳琪[19]研究发现，植物幼苗随着干旱胁迫程度的增加，MDA含量同样呈增高的趋势。花青素属于黄酮类化合物，而黄酮类化合物具有清除自由基和抗氧化的生理活性功能，在植物生长中起调节作用。查阅文献可知花青素能够清除和抑制-OH、H2O2等活性氧[24]。由此可见，测量红茎、绿茎马齿苋幼苗在干旱胁迫下的POD活性、MDA含量、花青素含量，可以反映出马齿苋幼苗在干旱胁迫下植株发生过氧化作用的程度，从而了解红茎、绿茎马齿苋幼苗抗旱的能力。在本研究中，随着干旱胁迫程度的加强，使得红、绿茎马齿苋中的花青素含量和MDA含量增加、POD活性增强，其中干旱10 d与对照组相比均有显著性差异。并且，同一干旱胁迫程度下，红茎马齿苋中花青素的含量显著性高于绿茎(图5)，POD活性也高于绿茎马齿苋(图6)，而MDA含量低于绿茎马齿苋(图4)，说明红茎马齿苋对干旱的耐受能力高于绿茎马齿苋。

马齿苋是具有药食两用的重要植物之一，本实验对干旱胁迫下红茎、绿茎马齿苋幼苗的株高、茎叶生长情况以及可溶性糖含量、MDA含量、花青素含量和POD活性这些指标的测定，阐明了这两种不同生态型马齿苋具有一定的抗旱能力，且红茎马齿苋对干旱的耐受能力强于绿茎，本研究为开发新的耐旱马齿苋品种奠定了一定的理论和实验基础。