灵芝孢子壳聚糖分离提取工艺优化研究

丛文钦，陈 罡，祝儒刚，高英旭*，赵济川，范俊岗

（1.辽宁大学 轻型产业学院，辽宁 沈阳 110036；2.辽宁省林业科学研究院，辽宁 沈阳 110032）

壳聚糖（Chitosan）是一种由2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖通过β-（1→4）糖苷键连接而成的线性多糖，也是唯一大量存在的阳性多糖，主要来源于几丁质（Chitin，又名甲壳素）经强烈碱水解或生物酶分解脱去N-乙酰基的过程[1]。相较于几丁质，壳聚糖具有更高的溶解性和更完善的功能特性，如抗菌性、抗氧化性、生物相容性、组织相容性等性质[2]。正因如此，壳聚糖在食品、医药、化妆品等众多领域有着广泛的应用，是一种极具应用前景的天然多糖。传统市售商品化壳聚糖来源于海洋副产品，制备过程需脱盐、脱矿、脱蛋白等众多化学反应步骤，既不能免除虾蟹等海洋副产品带来的致敏性问题[3]，又可能受到来自众多反应过程中的污染。因此，探究更多天然壳聚糖来源的研究十分具有现实意义。

灵芝孢子是担子菌门多孔菌科腐生真菌灵芝Ganodermalucidum的生殖细胞，具有灵芝全部遗传生物活性物质，如多糖、三萜、甾醇等物质，有多种功效和医学研究价值。其主要结构为双层壁结构，以透明外孢壁和深褐色内壁组成，主要成分为几丁质[4]，这也导致灵芝孢子粉内部生物活性物质难以被人体直接吸收。将其内活性物质提取后再进行利用则可避免直接服用导致的消化不良、便秘等症状，但提取后的残渣若弃之不用，便会造成灵芝资源的浪费。因此，本研究采用过程较为简单的化学法将灵芝孢子粉破壁后残渣中的壳聚糖进行分离纯化，并对提取工艺进行优化，以制备具有良好品质的灵芝孢子壳聚糖，为壳聚糖的分离纯化提供新的方向和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

灵芝孢子粉残渣为灵芝孢子粉（取自辽宁省林业科学院新宾县灵芝栽培示范基地）用破壁机破壁后收集所得残渣。实验用试剂氢氧化钠、盐酸、冰乙酸、过氧化氢均为分析纯。其中，氢氧化钠购自天津市大茂化学试剂厂；盐酸购自天津市永大化学试剂有限公司；冰乙酸购自天津博迪化工股份有限公司；过氧化氢购自沈阳市东兴试剂厂。

1.2 试验方法

1.2.1 壳聚糖的提取

1.2.1.1 几丁质的制备

将提取过生物活性物质后的灵芝孢子残渣烘干后研细，按照Liao等[5]的方法，准确称取一定质量的灵芝孢子粉残渣与2%NaOH以1∶20（g：mL）的比例置于85℃水浴中4 h。结束后，待混合液冷却，在7 000 r·min-1、室温条件下离心15 min，收集沉淀物并用超纯水清洗至中性，置于65℃烘箱中干燥过夜，保存待用。

1.2.1.2 脱 色

按照Chen等的方法[6]，将灵芝孢子几丁质与30%H2O2以1∶10（g：L）的比例置于70℃水浴中进行漂白2 h。待混合物冷却后，用NaOH溶液将混合物pH值调节至中性，在室温条件下7 000 r·min-1离心10 min，收集沉淀即为灵芝孢子几丁质，干燥备用。

1.2.1.3 几丁质脱乙酰基制备壳聚糖

根据朱礼芳[7]所述方法，取灵芝孢子几丁质1 g，按照设定比例与一定质量分数的NaOH溶液充分混匀，然后置于热水浴中保持预设时间。结束后冷却，在室温条件下7 000 r·min-1离心15 min，收集沉淀，用超纯水洗涤至pH值7，静置过夜，再次离心，将沉淀物烘干，即为粗灵芝孢子壳聚糖。

1.2.1.4 壳聚糖的纯化

将粗灵芝孢子壳聚糖与质量分数10%的醋酸溶液混合，超声辅助使其溶解，在7 000 r·min-1条件下离心10 min，弃去沉淀，取上清液再用质量分数为30%的氢氧化钠溶液调节pH值＞9，此时出现大量白色沉淀。将所得混合液再次离心，收集沉淀并洗涤至pH值呈中性，于65℃烘箱烘干即为灵芝孢子壳聚糖。

1.2.2 单因素试验

分别以NaOH质量分数、反应温度、反应时间3个因素作单因素试验，考察各单因素对灵芝孢子壳聚糖脱乙酰度及产率的影响情况。

1.2.2.1 NaOH质量分数

固定料液比1∶30，NaOH质量分数分别为10%、20%、30%、40%、50%，于90℃水浴5 h，研究不同质量分数NaOH对壳聚糖脱乙酰度及产率的影响。

1.2.2.2 温度

固定料液比1∶30，NaOH质量分数为30%，分别于60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴5 h，研究不同温度对壳聚糖脱乙酰度及产率的影响。

1.2.2.3 时间

固定料液比1:30，NaOH质量分数为30%，于90℃水浴2 h、3 h、4 h、5 h、6 h，研究不同水洉时间对壳聚糖脱乙酰度及产率的影响。

1.2.3 正交试验

基于单因素试验结果确定范围，以灵芝孢子几丁质为原料，以壳聚糖的脱乙酰度为因变量，以NaOH质量分数、反应温度和反应时间为自变量，通过正交试验（表1）进行工艺参数优化，确定灵芝孢子壳聚糖的最佳提取工艺条件。

表1 正交试验各因素及水平

1.2.4 壳聚糖质量指标分析

本试验以水分、灰分、酸溶性、脱乙酰度、粘度等指标对壳聚糖质量进行分析，参照GB 29941-2013《食品安全国家标准食品添加剂脱乙酰甲壳素（壳聚糖）》。

1.2.5 数据处理

本试验平行组均为3组，结果取平均值。采用SPSS软件（SPSS Statistics v18，IBM，UK）统计分析数据，采用Excel软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素对壳聚糖脱乙酰度及产率的影响

2.1.1 NaOH质量分数

由图1可知，灵芝孢子壳聚糖脱乙酰度总体趋势随着NaOH质量分数的增加而增加，在10%～30%范围内脱乙酰度增加较快，达到30%以后趋于平缓；壳聚糖产率在质量分数大于30%时下降较为明显，可能是随着NaOH质量分数的增加，壳聚糖分解加剧而导致的[8]。因此，选择质量分数为30%的NaOH较为合适。

图1 NaOH质量分数对壳聚糖脱乙酰度及产率影响

2.1.2 温 度

由图2可知，灵芝孢子壳聚糖脱乙酰度随反应温度逐渐增加，几丁质乙酰基在碱的作用下转化为氨基的反应更加剧烈，90℃后变化趋缓；正因如此，高温加剧了壳聚糖分子的降解反应[9]，导致壳聚糖产率大幅下降。温度在80℃时基本可以保证壳聚糖的脱乙酰过程进行，同时对于产率影响较小，因此80℃为最适反应温度。

图2 温度对壳聚糖脱乙酰度及产率的影响

2.1.3 时间

由图3可知，时间对壳聚糖脱乙酰度及产率影响与NaOH质量分数、反应温度相似。脱乙酰度在反应进行4 h后趋于平稳，但产率也开始快速下降，可能与壳聚糖分解反应逐渐加剧有关，因此反应时间控制在4 h能达到较好的提取效果。

图3 时间对壳聚糖脱乙酰度及产率的影响

2.2 正交试验

根据单因素试验得到的最适反应范围，以壳聚糖脱乙酰度为单一变量进行正交试验，结果如表2所示。其中，9号试验组的脱乙酰度最高（91.27%），能得到质量相对较好的壳聚糖，可视作试验中最佳反应条件。根据单因素分析法比较表3中F值可知[6]，各因素对壳聚糖脱乙酰度影响程度为NaOH质量分数＞温度＞时间；由同一水平各因素极差K值大小关系可知最优条件组合为40%NaOH、90℃、4 h，这与获得最好效果的9号试验组结果一致。

表2 正交试验结果

表3 正交试验方差分析

2.3 灵芝壳聚糖质量指标

采用正交优化后的工艺制备灵芝孢子壳聚糖，以壳聚糖产品国家GB29941-2013标准比较其产品指标情况，结果见表4。所得到的灵芝孢子壳聚糖具有良好外观品质，易溶于酸，脱乙酰度较高，且可重复性好，因此具有较高利用价值。

表4 灵芝壳聚糖质量指标

3 结论

来源于真菌的壳聚糖产品不但具有壳聚糖良好的性能，同时也能避免海洋副产物带来的不良问题，为壳聚糖的应用带来新的方向，因此十分具有潜力。本试验利用灵芝孢子粉破壁后收集的残渣所制备的几丁质来提取壳聚糖，既实现了灵芝孢子粉的高效利用，又为探索一种新来源的壳聚糖提供了坚实的理论基础。

本实验对化学法提取灵芝孢子壳聚糖工艺进行优化，研究了NaOH质量分数、反应温度、反应时间3个因素对于壳聚糖脱乙酰度及产率的影响，并对提取的灵芝孢子壳聚糖进行质量指标分析。结果发现NaOH质量分数对灵芝孢子壳聚糖的脱乙酰反应影响最为显著，碱液含碱量越高几丁质脱乙酰过程越剧烈，壳聚糖脱乙酰度越高。其他两因素也存在相同的影响趋势。但随着反应条件的增强，壳聚糖的分解也越强烈，将导致产率大幅下降，因此选择足够且较为适度的脱乙酰条件至关重要。在此基础上进行3因素3水平正交试验，并得到了灵芝孢子壳聚糖提取的最佳工艺：NaOH质量分数为40%、温度90℃、水浴时间4 h，得到的壳聚糖脱乙酰度为91.52%，水分、灰分、粘度等指标均符合相关标准中对于壳聚糖产品的质量要求，这说明经本试验优化后的灵芝孢子壳聚糖提取工艺能达到较为理想的水平。在后续试验中，还需对此壳聚糖理化性质、生物活性等进一步研究，以达到综合分析的目的。