青霉素侧链结构对其聚合反应的影响探讨

张夏 伍启章 胡昌勤

(中国食品药品检定研究院，北京 102629)

对药物杂质谱(impurity profile)特别是对其中微量/痕量毒性杂质的控制是当前药品质量控制的热点之一[1]。精准地识别药品中的特定毒性杂质，控制其在产品中的含量，是保证药品安全性的重要措施。

青霉素类抗生素是临床中最早使用且目前仍被广泛应用的抗感染药物。青霉素过敏反应是限制其临床应用的重要不良反应。青霉素聚合物是药物引发过敏反应的重要过敏原[2]；目前各国药典对青霉素类抗生素聚合物的控制均予以了高度重视。青霉素在水溶液中可以聚合，其聚合物可以引发速发型过敏反应这一现象早已经被人们所认知[3-5]。各国药典均已收载了6位含有氨基的青霉素，如：氨苄西林和阿莫西林等的聚合物结构。欧洲药典(EP)和美国药典(USP)在苯唑西林钠和替卡西林钠的各论中，还分别收载了6-APA氨基与青霉素羧基通过酰胺键形成的异聚体结构，在哌拉西林钠各论中收载了氨苄西林通过氨基与哌拉西林羧基形成的二聚体结构。针对不含氨基的青霉素分子的聚合物结构的报道仍较少见，我们提出了青霉素类抗生素的3种可能聚合方式，并利用计算化学的方法，推测聚合过程的反应途径与反应机理，推断优势聚合反应；再选择青霉素G和氨苄西林作为分子侧链不含氨基和含有氨基的青霉素类药物的代表，利用LC-MS分析加速聚合样品和实际样品，对理论计算结果进行验证。结果显示，侧链不含氨基的青霉素通过母核的2位羧基攻击另一分子的β-内酰胺环是重要的聚合反应途径，而对侧链含有氨基的青霉素如氨苄西林等，氨基攻击另一分子β-内酰胺环的聚合反应为优势反应[6]。青霉素羧基与β-内酰胺环的聚合反应在青霉素V钾中也已经被发现[7]，提示该反应途径可能是侧链不含氨基结构的青霉素的共性聚合途径。本文进一步选择苯唑西林钠和磺苄西林钠，分别作为侧链为苯甲异恶唑类青霉素和侧链具有较强吸电子基团青霉素的代表，进一步探讨侧链结构对青霉素聚合反应的影响。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

苯唑西林对照品、磺苄西林对照品(中国食品药品检定研究院)，注射用苯唑西林钠(批号：30193216095022)，苏州二叶制药有限公司产品)，注射用苯唑西林钠(批号：19030501)，注射用磺苄西林钠(批号：19011241，山东瑞阳制药股份有限公司产品)。

甲醇、乙腈为色谱纯(Fisher)，磷酸二氢钠、盐酸、氢氧化钠为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 加速聚合样品的制备

分别称取苯唑西林对照品和磺苄西林对照品适量，各3份，用水分别溶解并制成浓度约为100 mg/mL溶液，再用0.1 mol/L NaOH溶液分别调节pH制成约6.0(弱酸)、7.0(中性)和8.0(弱碱)的溶液，室温放置15 d，稀释20倍后分析。

1.3 HPLC-UV法分析聚合物

按中国药典2020年版中青霉素有关物质分析方法[8]。岛津LC-20AT高效液相色谱仪，配DAD检测器，工作站为LabSolutions；流动相A：以磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾10.6 g加水至1000 mL用磷酸调节pH值至3.4)-甲醇(72:14，V/V)；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0、17、41、53、54和65 min时，流动相A的比例为86.5%、86.5%、64%、64%、86.5%和86.5%；检测波长为225 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为34℃；色谱柱为资生堂Capcell Pak MG Ⅱ(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

1.4 柱切换LC-MS法分析聚合物

资生堂高效液相色谱仪(3201 S1-2双元泵，3202 S1-2真空脱气机，3014 S1-2柱温箱，3012 S1-2柱切换系统，3133 S1-2自动进样器)；Thermo Fisher Accela二极管阵列检测器；AB SCIEX 3200Q TRAP质谱仪；色谱分析工作站为岛津EZChrom Elite 软件，质谱分析工作站为AB SCIEX Analyst® 软件(1.4.2 版)。

柱切换方法参考文献[9]。一维色谱系统：同“1.3”项；二维色谱系统：柱温为室温，流速为0.5 mL/min，流动相A为含0.5%甲酸的水溶液，流动相B为含0.5%甲酸的乙腈溶液，梯度洗脱程序：在0、tR+5.5、tR+20.5和65 min时，流动相A的比例为100%、100%、0和0，色谱柱为资生堂Capcell Pak MG Ⅱ(4.6 mm×150 mm，5 μm)。

质谱参数：对于苯唑西林及其杂质，电离电压为4000 V，气化温度为 400℃，去簇电压为26 V，碰撞电压为33 V，碰撞电压变化幅度为0；对于磺苄西林及其杂质，电离电压为 4000 V，气化温度为400℃，去簇电压为24 V，碰撞电压为40 V，碰撞电压变化幅度为0。扫描模式为EMS和EPI，扫描范围为m/z100～1200。

1.5 聚合反应的模拟理论计算

参考文献方法研究聚合反应机理[6]。理论计算采用Gaussian 09软件，选取用密度泛函理论(density function theory，DFT)中的B3LYP方法，基组采用6-311 G(d，p)。对势能面上的所有反应物、过渡态、中间体及产物进行结构优化和频率计算，保证所有驻点均无虚频，马鞍点即过渡态有且仅有一个虚频。苯唑西林和磺苄西林以PubMed的分子构型为优化起点，采用TS和QST2方法搜寻聚合反应的过渡态，结合分子几何结构优化和频率计算模拟反应途径。过渡态采用内秉反应坐标(intrinsic reaction coordinate，IRC)计算从正反应和逆反应两个方向确认过渡态的结构是否连接反应物和产物，绘制对应的能垒图，计算反应活化能。势能面上能量大小用吉布斯自由能表示，能量单位为kcal/mol。

2 结果与讨论

2.1 对苯唑西林聚合反应的分析

苯唑西林(oxacillin)为苯甲异恶唑类青霉素，其侧链结构不含氨基。理论计算表明，苯唑西林聚合反应Ⅰ(母核的羧基与另一分子β-内酰胺环的反应)和聚合反应II(母核β-内酰胺环开环形成的羧基与另一分子β-内酰胺环的反应)均为吸热反应。限速步骤均为第二步基元反应，聚合反应I的能垒为38.53 kcal/mol，聚合反应II的能垒为66.44 kcal/mol(图1)，提示聚合反应I为优势反应，与文献[6]中青霉素G的聚合反应相似。

图1 苯唑西林聚合反应能量图Fig.1 Energy diagram of oxacillin polymerization reaction

根据文献[6]对青霉素类抗生素聚合反应机理的认知，苯唑西林聚合产物应以二聚体为主，主要产物为二聚体Ⅰ，其水解可形成开环物；此外，还可能存在少量的二聚体Ⅱ(图2)。采用HPLC分析加速样品，苯唑西林在弱酸、中性和弱碱性溶液中的降解产物相似，弱碱溶液中主峰后杂质更丰富(图3)。采用LC-MS方法，分析主要聚合产物二聚体，进一步确证理论计算结果。

图2 苯唑西林二聚体的可能结构Fig.2 Possible structures of oxacillin polymers

色谱峰4的一级质谱图(图4A，EMS图)中存在m/z802.7和m/z840.6的准分子离子峰，分别为[M+H]+和[M+K]+峰，提示其分子量为802 Da，与二聚体I的分子量相同；二级质谱图(EPI图)中的主要裂解碎片离子(m/z644、m/z402、m/z384、m/z243等)符合聚合物Ⅰ的裂解规律(图4B)，提示色谱峰4为苯唑西林二聚体Ⅰ。色谱峰4是强制聚合样品中的主要聚合产物(图3)，进一步验证了聚合反应Ⅰ为苯唑西林优势聚合反应途径的理论计算结果。

图3 苯唑西林强制聚合样品的色谱图Fig.3 Chromatograms of oxacillin polymerization samples

图4 苯唑西林强制聚合样品的色谱图Fig.4 Chromatograms of oxacillin polymerization samples

色谱峰1、2和3的EMS图(图5A)中存在m/z820.8、m/z842.9、m/z874.7的准分子离子峰，分别为[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+峰，提示它们的分子量均为820 Da，可能为聚合物Ⅱ或聚合物Ⅰ的开环物。

色谱峰1和3的质谱图相似，与色谱峰2的质谱图明显不同(图5A)。色谱峰1和3二级质谱图(图5A)中的主要裂解碎片(m/z402、m/z376、m/z384、m/z243等)符合聚合物Ⅱ的裂解规律(图5B)，提示可能为二聚体Ⅱ。由聚合物Ⅱ的聚合反应机理可知，母核β-内酰胺环开环后可形成非对映异构体，因此，推测色谱峰1和3为二聚体Ⅱ的一对异构体，与聚合物Ⅱ的聚合反应机理相符合。

色谱峰2的二级质谱图(图5A)中的主要裂解碎片(m/z402、m/z643、m/z579、m/z374、m/z243等)符合聚合物Ⅰ开环物的裂解规律(图5C)，推测其为聚合物I的开环产物。

图5 苯唑西林二聚体的质谱分析结果Fig.5 LC-MS results of oxacillin polymer

对2批苯唑西林钠实际样品进行分析，杂质种类相似，色谱图见图6。二聚体I位置未见色谱峰，46.2min处的杂质峰经质谱验证为二聚体I的开环物。与对青霉素G实际样品的分析情况相同[6]，提示固体条件下聚合物I主要以开环物的形式存在。

图6 苯唑西林钠实际样品的色谱图(2为聚合物I开环物)Fig.6 Chromatogram of oxacillin real samples

2.2 对磺苄西林聚合反应的分析

磺苄西林(sulbenicillin)侧链具有较强的吸电子基团，采用相同的理论计算方法磺苄西林聚合反应，结果显示，磺苄西林聚合反应机理与苯唑西林相似，聚合反应I为优势反应；聚合产物应以二聚体为主，主要产物为二聚体Ⅰ，其相对分子质量为828，聚合物Ⅱ的相对分子质量为846(理论计算结果略)。

采用HPLC分析加速聚合样品，磺苄西林在弱酸、中性和弱碱性溶液中的降解产物相似，弱酸溶液中主峰后的杂质更丰富(图7a)，但与苯唑西林强制聚合样品比较，杂质峰较少且含量较低。

图7 磺苄西林各样品色谱图Fig.7 Chromatogram of sulbenicillin samples

采用LC-MS对强制聚合样品中含量相对较高的色谱峰1、2和3进行分析。依据EMS图中的准分子离子峰，其可能的分子量分别为318、432和540 Da，均不可能是磺苄西林二聚体，而是小分子杂质。对磺苄西林实际样品中含量相对较高的杂质峰4(保留时间约29 min)进行质谱分析，证明其也不是二聚体杂质，提示在磺苄西林钠样品中聚合反应不易发生。

理论计算结果显示磺苄西林可以发生聚合反应，但不管是在强制聚合样品还是实际样品中均未能发现聚合产物，理论分析与实际情况的差异原因有待于进一步的研究。该结果提示，采用强制聚合反应对理论分析结果进行验证不仅必要，而且是聚合物分析的最佳方案。

3 结论

本文进一步证明了文献[6]提出的青霉素聚合反应机理：基于母核结构的青霉素聚合反应包括二类：聚合反应Ⅰ：青霉素母核的羧基与另一分子β-内酰胺环的反应；聚合反应Ⅱ：青霉素母核水解开环，新形成的羧基与另一分子β-内酰胺环的反应。但青霉素侧链结构对该聚合反应具有明显影响，侧链具有较强吸电子基团的青霉素如磺苄西林不易发生聚合反应，其有关机理有待于进一步研究。

本文的结果显示，理论分析结合强制聚合反应验证是青霉素聚合物分析的理想方案；采用LC-MS方法，根据聚合物的质谱裂解途径，结合聚合反应机理，可以较好的推断聚合物的结构。