江西省高安市两株汉城病毒分离鉴定及全基因组序列分析

刘师文，张艳妮，肖 芳，周 珺，刘晓庆，熊 英，吴杨博文，龚 甜

汉坦病毒(Orthohantavirus，HV)是汉坦病毒科，正汉坦病毒属有包膜、分节段的负链RNA病毒，啮齿类动物为其自然宿主，人类通过吸入被HV感染动物的排泄物气溶胶可引起肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)或汉坦病毒肺综合征[1]。HV在世界范围内流行，对人类造成了严重危害，HFRS也是中国最严重的鼠传疾病之一[2]。HV病毒基因组分为S、M、L 3个基因片段，分别编码核衣壳蛋白、糖蛋白前体及RNA依赖的RNA聚合酶。正汉坦病毒属目前有38个种，在我国流行最广并明确导致肾综合征出血热的种为SEOV和汉滩病毒(Hantaan orthohantavirus，HTNV)。

高安市是江西省历年HFRS发病最严重的区县之一，从2005年开始开展人间和鼠间HFRS监测，为国家级HFRS监测点。2011年本实验室基于HV部分M基因测序分析，发现江西上高(与高安市接壤的县)地区出现了与现有流行SEOV株基因序列差异较大，在基因进化树上独立分支的SEOV(SG42/2011株)[3]， 后续在高安市持续监测到与之高度同源的病毒(GAN44/2014、GANS49/2015株等)[4]。因为前期获得的基因序列信息仅为M基因片段(长400 bp左右)，对流行株整体变异情况、基因组与疫苗株匹配程度等无法进行更深入的分析，所以本实验室重点对高安市鼠类样本开展HV病毒分离和全基因组测序研究，以期更深入了解高安市流行的SEOV变异株遗传变异信息，为HFRS防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本 收集2021年江西省高安市鼠肺标本62份，经实时荧光RT-PCR法检测有6份HV阳性，2份SEOV 和4份HTNV，对6份HV核酸阳性样本进行病毒分离。

1.2 主要试剂和仪器 Vero-E6细胞、小牛血清、胎牛血清、MEM、细胞刮刀、荧光素标记的汉坦病毒抗体与文献[5]相同，高通量测序仪ABI Ion Gene Studio S5及测序试剂 (赛默飞)、倒置显微镜和荧光显微镜(尼康)，组织破碎仪(美国Next Advance)。

1.3 病毒分离及鉴定 采用灭菌手术剪剪下HV核酸阳性鼠肺至1.5 mL离心管中，加入适量无菌1×PBS溶液，离心管盖好放至组织破碎仪粉碎，制成10%鼠肺样本悬液。用封口膜封住离心管口防止离心管盖弹开。悬液经6 000 g，4 ℃离心10 min后，取上清0.8～1 mL接种长成75%单层的Vero-E6细胞。37 ℃吸附2 h；吸去残留液体加入含2%牛血清的MEM维持液，37 ℃培养。每7 d更换1次维持液，28 d传代1次，传代方法按照细胞传代方式进行。

1.4 培养物鉴定 分别在每次换液前吸取培养物上清进行核酸提取，采用实时荧光RT-PCR检测HV核酸，方法参照文献[6]。当实时荧光RT-PCR法检测Ct值出现明显降低且低于22时，用刮刀刮取少量细胞涂片进行直接免疫荧光检测。抗原片制备及直接免疫荧光检测方法参照文献[5]，抗原片出现特异性绿色荧光说明病毒分离成功。若连续传代3次未检出HV则分离结果为阴性。

1.5 鼠种鉴定 采用PCR方法扩增鼠肺样本中鼠线粒体细胞色素氧化酶基因(cytb)并测序，序列通过NCBI Blast比对确定鼠种，引物和扩增方法参照文献[7]。

1.6 分离株全基因组序列测定和分析 采用ABI Ion Gene Studio S5高通量测序仪对分离株核酸进行全基因组序列测定，采用CLC软件对测序仪数据分析获得全基因组序列，从GenBank下载HV参考株全基因序列，采用MEGA7.0、DNASatar等软件对基因序列进行比对分析，以最大似然法构建HV系统进化树(参考株序列信息见表1)。将分离株基因组序列与疫苗株基因组以及文献发表的HV B细胞和T细胞免疫表位进行比对分析，从基因层面分析疫苗保护效果。

表1 进化分析所用参考株的序列信息

2 结 果

2.1 实时荧光RT-PCR法检测培养物上清 每次换液前吸取培养物上清进行核酸提取，经荧光RT-PCR检测发现，2份样本(GAW30/2021，GAW50/2021，均为SEOV型)随着时间推移荧光Ct值明显降低。GAW30/2021，GAW50/2021培养物上清荧光RT-PCR检测扩增曲线图见图1、图2。GAW30/2021随着时间推移荧光强度逐渐增强，Ct值逐渐降低。GAW50/2021培养物核酸在21 d前荧光强度和Ct值变化不大，而在第28 dCt值发生明显变化。其余4份阳性样本培养物培养至3代，经荧光RT-PCR检测仍无特异性荧光信号，病毒分离结果为阴性。

图1 GAW30/2021培养物上清荧光RT-PCR检测图

图2 GAW50/2021培养物上清荧光RT-PCR检测图

2.2 直接免疫荧光检测 分别在接种后28 d、35 d(第2代第7 d)刮取少量GAW30/2021、GAW50/2021细胞制备抗原片，采用直接免疫荧光方法检测细胞内病毒颗粒(图3)。GAW30/2021、GAW50/2021分别在接种后28 d、35 d，大多数细胞内均可见到特异性绿色荧光颗粒。

注：A为GAW30/2021培养物(28 d)，B为GAW50/2021(35 d)，C为Vero-E6细胞对照。

2.3 鼠种鉴定 扩增GAW30/2021、GAW50/2021鼠肺样本中鼠cytb基因并测序，获得两条长411 bp鼠cytb基因序列，上传至GenBank，登录号分别为：MZ420337、MZ420336。 通过NCBI Blast比对确定，GAW30/2021鼠种为褐家鼠，GAW50/2021鼠种为黄毛鼠(也称罗赛鼠)。

2.4 基因组序列分析 经高通量测序获得分离株GAW30/2021、GAW50/2021基因组序列，2株分离株的3个基因片段大小相同，每个基因编码区长度一致。S、M、L基因分别含1 773、3 651、6 530个核苷酸，分别编码429、1 133、2 151个氨基酸，核苷酸序列同源性分别为99.7%、99.0%、99.4%、氨基酸序列同源性分别为99.8%、99.7%、99.9%。分离株基因序列详细信息可登录NCBI网站，GenBank登录号：MZ504237-MZ504242。

以最大似然法构建的系统进化树(图4、5、6)，其中SEOV 参考株S、M、L基因序列分别为21条、17条、11条，HTNV参考株为76-118株，本研究中的序列用黑圆形标志。图中括号内为相应参考株基因序列的GenBank登录号。由图可见，分离株GAW30/2021、GAW50/2021 S、M、L基因进化树上都分布在SEOV进化枝，与SEOV参考株遗传距离较远，呈独立分枝。

图4 汉坦病毒HV S基因核苷酸系统进化分析

图5 汉坦病毒 M基因核苷酸系统进化分析

图6 汉坦病毒 L基因核苷酸系统进化分析

GAW30/2021、GAW50/2021 与21株SEOV 参考株S基因编码区核苷酸同源性为88.8%～94.9%，氨基酸同源性为97.7%～99.8%，与江西上高SG42/2011株关系最近；与HTNV 76-118株的M基因核苷酸同源性均为73.3%，氨基酸同源性分别为84.2%、84.5%；与17株SEOV 参考株M基因编码区核苷酸同源性为84.3%～87.2%，氨基酸同源性为96.1%～98.3%，与HTNV 76-118株的M基因核苷酸同源性分别为71.9%，72.0%，氨基酸同源性分别为77.4%、77.6%；与11株SEOV 参考株L基因编码区核苷酸同源性为84.3%～84.6%，氨基酸同源性为97.2%～97.8%，与HTNV 76-118株的L基因核苷酸同源性均为75.1%，氨基酸同源性均为85.4%。

GAW30/2021株与SEOV疫苗株Z37基因S、M、L基因核苷酸同源性分别为89.7%、84.9%，84.6%，氨基酸同源性分别为98.8%、96.9%、97.6%，氨基酸变异位点数分别为5个、35个、51个； GAW50/2021株与SEOV疫苗株Z37基因S、M、L基因核苷酸同源性分别为89.5%、84.9%，84.7%，氨基酸同源性分别为99.1%、97.0%、97.7%，氨基酸变异为位点数分别为4个、34个、49个。

2.5 核蛋白和糖蛋白免疫表位氨基酸变异位点分析 将分离株S和M基因推导氨基酸序列与已发表的文献[8-12]中关于SEOV 核蛋白和糖蛋白上的免疫表位比较，分析分离株在免疫表位上氨基酸的变异情况。结果分离株核蛋白4 个免疫表位：72GKNIGQDRDPTGVEPGDHLKERSALSYGNTL-DLNSLDID110、165YEDVNGIRKP174、251PIAGSLSGNPVNRD264、338MRNTIMASK346均未发生氨基酸改变。Z37疫苗株与GAW30/2021、GAW50/2021株糖蛋白2个免疫表位(435GQKKTILTKTLVIGQ451、880PFSCPEFGQFRKKC894)中氨基酸序列一致。

3 讨 论

HV病毒分离是HV病原学研究非常重要的技术手段，该病毒分离技术早在20世纪80年代就已建立，在可分离的病毒中HV属于较难分离的病毒[13]。因为对样本要求高，分离周期长，病毒分离率低等原因，HV病毒分离技术应用得越来越少。中国现阶段使用的HFRS疫苗毒株主要为20世纪80年代分离，随着病毒的变异，存在现有疫苗对流行株缺乏免疫保护作用的风险。开展病毒分离，储备新的HV毒株，对开展流行毒株的抗原性及疫苗保护效能研究、指导HFRS疫情防控有非常重要的意义。

本研究从江西省HFRS重点疫区高安市分离到2株SEOV，2株分离株与国内外SEOV参考株全基因组核苷酸差异较大，同源性为84.3%～94.9%，氨基酸同源性为96.1%～99.8%，在系统进化树上独立分枝，证实了高安市鼠间流行的SEOV基因组发生了较大变异。目前尚未在人间HFRS疫情中发现该病毒，后期应加强人间疫情的监测。成功分离2株SEOV变异株，丰富了我国SEOV毒种的基因型别。

接种疫苗是预防HFRS最有效的手段。2株分离株与SEOV疫苗株Z37 基因组核苷酸差异较大，同源性为84.6%～89.7%，但氨基酸同源性仍较高，为97.6%～99.1%；核蛋白和糖蛋白的免疫表位氨基酸序列与Z37一致。因此，推断流行株虽然发生了较大变异，但是目前疫苗对流行株仍具有保护力，还应当持续监测病毒变异情况。

HV不同种病毒通常有稳定的宿主，如HTNV宿主主要是黑线姬鼠，SEOV宿主主要为褐家鼠[14]。本研究现场采样时，将GAW50/2021鼠种定为臭鼩鼱，通过鼠cytb基因检测，确定GAW50/2021鼠种为黄毛鼠(也称罗赛鼠)。因此，我们认为仅依靠鼠种外形特征以及采样人员的经验判断鼠种，容易产生误差。在确定病毒来源物种时，尤其是在得出“宿主溢出”[15]“宿主转换”[16]结论时应结合分子生物方法对鼠种进行鉴定。

本研究成功分离到2株SEOV变异株，丰富了我国SEOV毒种的基因型别，经全基因序列分析，推断目前疫苗对变异株仍具有保护力，为HFRS防控提供科学依据。

利益冲突：无

引用本文格式：刘师文，张艳妮，肖芳，等. 江西省高安市两株汉城病毒分离鉴定及全基因组序列分析[J]. 中国人兽共患病学报，2022，38(2)：102-107. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.023