犬脂肪干细胞分离、纯化的研究进展

包喜军 郭小望 李 刚 秦海斌 强京宁 贺星亮

脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells, ADSCs)是存在于脂肪组织中的、具有多向分化潜能的间充质干细胞，由Zuk等在2001年从吸脂术抽出的脂肪中首次发现。脂肪干细胞具有来源丰富、取材方便、容易获取、易于培养和免疫排斥低等优点，且具有分化为脂肪细胞、肌肉细胞、成骨细胞、神经细胞、心肌细胞和胰岛细胞等多种细胞的潜能。因此，脂肪干细胞已成为近年来医学领域乃至整个生命科学领域的研究热点。

目前，关于人、鼠脂肪干细胞的研究报道较多，而对犬脂肪干细胞的研究相对较少。犬作为常见的伴侣动物和重要的实验动物，开展犬脂肪干细胞的研究必将对于犬病临床诊疗和人类疾病的动物试验研究产生重要的影响。

一、脂肪组织的获取

（一）取材部位

脂肪组织在全身的分布广泛，但在采集脂肪组织进行脂肪干细胞的研究时，采集部位主要集中于腹部和腹股沟的皮下，也有研究者在臂部、臀部、乳房、内脏和大网膜等部位采集脂肪。在脂肪干细胞的产量方面：Schipper等认为人前臂脂肪组织中的干细胞含量最多；Faustini和Jurgens等则认为腹部脂肪干细胞产量高于其他部位；Fraser等认为侧腹的脂肪干细胞产量高于腹部；Iyyanki和Oedayrajsingh-Varma等认为腹部、臀部、乳房、侧腹和腋窝的脂肪干细胞产量无显著差异。在脂肪干细胞的增殖能力方面：多项研究表明皮下脂肪来源的脂肪干细胞增殖能力强，也有研究显示腹部皮下脂肪和其他部位脂肪的增殖能力无显著差异。

（二）取材方法

脂肪组织的获取方法有真空抽脂术、常规手术和微创手术等。吸脂术损伤较小，是目前获取脂肪的主要方法；常规手术获取脂肪损伤较大，但获取的脂肪较多，更便于脂肪干细胞的分离培养；微创手术取脂肪也是吸脂术的一种，相关报道较少，该方法在采集脂肪时，选用穿刺的方式将脂肪提取出来。无论采用何种方式，在采集脂肪后，应尽快将脂肪组织冷藏并进行下一步实验。在干细胞产量方面，Faustin和 Schreml等认为手术切除法和吸脂术提取的脂肪干细胞量相等；在成脂分化能力方面，Vallee等认为相较于其他方法吸脂术提取的脂肪干细胞具有更好的成脂分化能力；在不同提取物对干细胞生长活性影响方面，Sinno等认为注射器和真空泵吸脂，获得脂肪干细胞的活性未见明显差异。

（三）供体选择

研究的热点主要集中于供体的年龄、性别和健康状况等。有研究认为，年轻供体的脂肪干细胞产量、增殖速度和分化能力优于年老供体；也有研究显示，年龄因素并不影响脂肪干细胞的增殖、分化和衰老。Ogawa等认为雌性小鼠的成脂能力优于雄性，Aksu等认为男性的脂肪干细胞分化能力优于女性。有研究显示，肥胖者的脂肪干细胞分化能力较低；糖尿病大鼠和健康大鼠的脂肪干细胞，在体外的增殖速度和生长曲线无明显差异，而糖尿病大鼠的脂肪干细胞则会分泌更多的瘦素和脂连蛋白。

二、脂肪干细胞的分离

（一）组织块贴壁法

在无菌采集脂肪组织后，将脂肪组织转运至实验室，先用生理盐水冲洗，再通过双抗PBS冲洗、基础培养基冲洗等步骤后，将脂肪组织剪成适宜大小的组织块，然后贴放到培养皿中进行培养，为了使组织块贴壁更紧凑、不漂浮于培养液中，也可将组织块贴放到细胞培养皿中，于二氧化碳培养箱中培养30min，然后再滴加细胞培养液，于37℃、5%CO2饱和湿度下培养16h后补加培养液，继续培养，24h后换液，之后隔天换液，于倒置相差显微镜下，每天观察细胞生长形态和特征。

（二）酶消化法

酶消化法是目前主要的脂肪干细胞的分离方法，其原理是将已剪成碎块的脂肪组织，通过消化酶消化，以去除细胞间质，再经过滤、洗涤和离心等步骤去除其他细胞，从而最终获得脂肪干细胞。在选用酶的类型方面，Ⅰ型胶原酶最为常见，也有研究选用Ⅱ型、IV型、Ⅷ型胶原酶或者胰酶，以及胶原酶与胰酶联合应用；在酶的使用浓度方面，0.75g·L-1至2.5g·L-1不等；酶的消化时间从0.5h至3h不等。酶消化法是一种费时、昂贵的方法，且在使用酶的类型、浓度、消化时间等方面缺乏统一的标准。由于上述各种因素的影响，分离的脂肪干细胞表型、增殖和分化能力有一定差异。

（三）其他方法

1.其他人工分离方法：将吸脂术的液体通过特制材料制作的吸附柱，以此来获取脂肪干细胞的方法，该方法仅适用于抽脂术的液体成分，而且需要大量的样品，且细胞提取率不高。此外，还有直接离心法、机械振荡法和胎牛血清法等。这些方法的优点是不使用胶原酶，避免了异种污染，但组织消化时间长、干细胞产量低，但也有研究认为直接离心法和机械振荡法获取的脂肪干细胞其活动更高、生长速度更快；胎牛血清法是一种利用体积分数为100%的胎牛血清，替代胶原酶和胰蛋白酶来消化脂肪组织的方法。

2.自动分离方法：除了人工分离方法外，目前市场上还有几种商业化的脂肪干细胞自动分离系统，例如Cytori公司的Celution System，Tissue Genesis公 司 的Icellator X System等。Celution System是通过一次性无菌耗材自动化和标准化分离和富集脂肪干细胞，该系统使得实时获取自体、临床级的脂肪干细胞流程变得更加简易，并可在同一个外科手术过程中实现床旁细胞治疗。Icellator X System是一款高性能的医疗点设备，可以在完全封闭的自动化过程中，无须人工干预，在不超过一小时的时间里，从自体脂肪组织小型样本中有效提取足以用于静脉输液的成年人干细胞。

三、脂肪干细胞的纯化

（一）细胞传代培养纯化法

根据脂肪干细胞贴壁生长的特性，可以将脂肪干细胞与大部分的细胞进行分离，但是，在基质血管成分中成纤维细胞也能贴壁，且贴壁后的细胞形态也为梭形，因此无法通过形态区分脂肪干细胞，但是有研究认为原代培养48h后，所有贴壁的活细胞均为脂肪干细胞。该方法的主要步骤为：将分离获得的脂肪干细胞在37℃、5%CO2及饱和湿度培养条件下，培养24h，更换培养液去除未贴壁细胞，在细胞融合达70%～80%时弃培养液，PBS漂 洗2次，每 次10min，弃PBS，使用0.25g·L-1胰蛋白酶消化贴壁细胞2次，每次10～20s，培养液冲洗并获得原代细胞，按上述方法依次进行传代培养。

（二）流式细胞术纯化法

流式细胞术是一种比较成熟的干细胞纯化、鉴定的方法，其主要步骤如下：

1.脂肪干细胞的准备：将胰酶消化或未消化的脂肪干细胞移入流式管内，800-1000r/min离心4～5min，取细胞沉淀，重复洗涤 2次，PBS重悬，将细胞浓度调整为（2.0～6.0）×106ml-1待用。

2.干细胞与抗体的孵育：将准备好的细胞样品加入已加入抗体（CD34、CD44、CD45、CD105等）试剂的流式管内，每管100μL，充分混匀，置4℃冰箱避光孵育30min，孵育完成后每管加入PBS1ml，充分混匀，1000r/min离心5min，取细胞沉淀，重复洗涤1次，最终加入200μL重悬。

3.应用流式细胞仪检测：文依信等使用流式细胞仪对犬的P3代脂肪干细胞进行了检测，间充质干细胞表面标记蛋白CD29高表达（＞90%），而几乎不表达造血细胞标记蛋白CD34和CD45（＜2%）。由于选择表面标记蛋白和实验方法的不同，细胞表面高表达的标记蛋白有CD44、CD90和CD105等；完全不表达的标记蛋白有CD31和CD45等；而造血干细胞标记蛋白CD34也有低表达或不表达的报道。此外，李珂雅等在用流式细胞仪对不同物种的脂肪干细胞表面标记物研究时发现，不同物种的脂肪干细胞表面标记物类似，这为脂肪干细胞的临床前研究提供了良好的模型。

（三）免疫磁珠分选法

该方法与流式细胞术纯化方法相似，不同点在于流式细胞分选是电荷式分选，而免疫磁珠分选是使用磁珠偶联的特异性单抗去标记细胞表面抗原，当已标记好的单细胞悬液通过特定的外加磁场分选柱时，仅有与磁珠相结合的细胞才被吸附滞留在分选柱内，从而使细胞得以分离。免疫磁珠分选法将细胞生物学、磁力学和免疫学等知识融于一体，具有高度特异性分选细胞的特点。

（四）密度梯度离心法

密度梯度离心法是基于不同颗粒沉降系数的差异，在一定离心力作用下，不同颗粒以不同速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带，从而使不同密度的细胞得以分离。目前常用的离心介质有聚蔗糖（Ficoll）和经过聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒混悬液（Percoll）。有研究显示，Ficoll更适用于制备人骨髓间充质干细胞，而Percoll在分离纯化马骨髓间充质干细胞时的细胞产量及自我更新潜能方面效果更佳。也有研究显示不同密度的Ficoll，其分离纯化的骨髓间充质干细胞在细胞的活性、产量、表型等方面差异显著。因此，实施密度梯度离心法的关键在于介质及其密度的选择。有研究通过该方法对负压抽脂采集的猪皮下脂肪进行了干细胞分离，最终成功获取了脂肪干细胞。

四、脂肪干细胞的应用前景

脂肪干细胞在组织损伤的修复、炎症、自身免疫系统病、神经退行性疾病等多种疾病的治疗中取得了较好的疗效，这使得对该细胞的研究不断深入。犬作为最常见的伴侣动物和新型实验动物，随着与人类工作和生活关系的逐渐密切，犬脂肪干细胞对多种疾病的疗效，逐渐成为兽医和人类临床前动物试验工作者关注的焦点，如骨关节炎、髋关节发育不良、关节软骨损伤、心肌梗死、糖尿病、肝功能衰竭、肾功能衰竭和肺心病等，对人类疾病的诊疗也具有重要的参考价值。另外，有研究表明，犬脂肪干细胞具有肿瘤趋向性，因此可作为抗肿瘤分子的细胞载体，对于肿瘤疾病的治疗也具有重要意义。