基于代谢笼试验的鸡粪中雌激素排放特征研究

梁紫薇，李艳，胡嘉梧，贺德春*，邹梦遥，杨莹，陈冰娜

（1.仲恺农业工程学院资源与环境学院，广州 510225；2.生态环境部华南环境科学研究所农村环境研究团队，广州 510530；3.重庆三峡学院环境与化学工程学院，重庆 404199）

环境雌激素是一类具有较强内分泌干扰性的化合物，包括雌酮（E1）、雌二醇（E2）、雌三醇（E3）等内源性雌激素和17α−乙炔基雌二醇（17α−EE2）、己烯雌酚（DES）等人工合成雌激素，以及其他具有雌激素效应的化合物。雌激素因其较强的生态与健康危害，已成为一类备受学术界关注的有机污染物。据报道畜禽粪污是环境雌激素的重要来源之一，有文献表明，畜禽粪污约贡献了环境雌激素总量的90%；2010 年，我国畜禽雌激素总排放量为2 046 t，其中，E1、E2 和E3 的年总排放量分别为71.7、23.5 t 和1 185.0 t，对环境中E1、E2（17β−E2）和E3 的贡献率分别高达93%、94%和98%。另据估算，2015 年全球畜禽粪污中E1、E2 和E3 的总排放量分别为531、206 t 和13 225 t，其中鸡粪中E1、E2、E3的总排放量分别为6.1、25.5、16.9 t。

近年来，我国畜禽养殖规模化、集约化发展趋势明显，家禽粪污更趋向于集中排放，由家禽养殖导致局部地区的环境雌激素污染问题也更加严峻。当前，国内有关畜禽粪便雌激素的研究主要集中在猪粪和牛粪方面，关于家禽粪便中雌激素的排放特征研究较少，而且多数是基于单次采样或混合采样而开展的，研究对象多为蛋鸡且样品数量较为有限，未能考虑不同家禽个体和不同季节经粪便排放的雌激素含量的差异，据此含量特征测算的雌激素排放量与实际可能存在差异，不利于科学准确地进行畜禽粪便中雌激素环境污染的治理与防控。我国肉鸡养殖量大，开展肉鸡粪便雌激素排放特征研究具有重要意义。

本文以肉鸡为研究对象，系统研究肉鸡不同个体、不同季节排放粪便中4种内源性雌激素（E1、17α−E2、17β−E2、E3）和2 种人工合成雌激素（17α−EE2、DES）的含量与组成特征，以期为科学准确地测算禽类粪便雌激素排放量、制定合理的污染与风险防控对策等提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点与试验动物

本试验在四川省成都市某肉鸡养殖场进行，试验对象为同一品种且日龄相同的肉鸡，体质量范围在1.36~1.51 kg。试验分4批次进行，每个季节分别饲养一批，试验过程中的饲料、饮水、环境与该养殖场常规饲养管理条件一致。试验期间当地平均气温范围为冬季4~10 ℃、春季14~22 ℃、夏季20~30 ℃和秋季

14~20 ℃。

1.2 粪便收集

采用代谢笼定位饲养，在养殖场内挑选25 只日龄相同、体质量相近的肉鸡，按每笼5 只为一组进行喂养，笼下铺设薄膜以方便收集肉鸡粪便。

1.3 样品采集与保存

采样时间与频率：喂养试验分别在2018 年12 月（冬季）、2019 年3 月（春季）、6 月（夏季）和10 月（秋季）开展，每个批次连续监测3 d。

样品采集：每日上午分别收集每组代谢笼肉鸡排泄的所有新鲜粪便样品，称量并记录粪便质量，每组鸡粪样品均分装成3 份，其中2 份样品加入4 mol·L的稀硫酸，用于测定雌激素，1 份样品不加稀硫酸，用于测定含水率。样品用密封袋装好，4 h 内运回实验室，放入−20 ℃冰箱冷冻保存。

1.4 样品预处理与检测方法

称取经真空冷冻干燥且研磨过筛（20 目）后的肉鸡粪便样品（1.00±0.01）g，采用本团队优化的畜禽粪便雌激素测定方法（同位素内标−高效液相色谱−串联质谱法）进行样品预处理和仪器分析检测。

1.5 数据处理及分析

1.5.1 雌激素活性当量计算方法

雌激素的环境污染风险在于其内分泌干扰作用，即雌激素活性。为更直观有效地反映目标雌激素的雌激素效应，以雌二醇（17β−E2）的内分泌干扰作用大小为基准，采用17−E2 当量（）来表征鸡粪中各雌激素的活性大小，以评价其环境风险。计算公式为：

式中：MEC为各目标雌激素的实测含量，μg·kg；EEF为各目标雌激素的17−E2 当量因子，E1、17−E2、17−E2、E3、17−EE2 和DES 的分别为0.59、0.125、1、0.26、8.71和8.0。

1.5.2 样品含水率计算

根据《复混肥料中游离水含量的测定真空烘箱法》（GB/T 8576—2010），求得粪便样品的含水率，计算公式为：

式中：为干燥前样品的质量，g；为干燥后样品的质量，g。

1.5.3 雌激素日排放量计算方法

通过每羽肉鸡粪便日平均产生量（）和粪便样品中雌激素含量计算每羽肉鸡雌激素日排放量，计算公式为：

式中：Q为各雌激素日排放量，μg·d；MEC为各目标雌激素的实测含量，μg·kg；为每羽肉鸡粪便日平均产生量，kg·d；为肉鸡粪便含水率，%。

1.5.4 数据处理及统计学分析

采用Excel 2010 整理数据，采用SPSS Statistics 20.0 中单因素方差分析（ANOVA）和Tukey HSD 事后检验对数据进行差异显著性分析，使用Originlab 2018制图。

2 结果与讨论

2.1 肉鸡粪中雌激素的含量特征

在调查的6 种雌激素中，与人工合成雌激素（17−EE2、DES）相比，内源性雌激素（E1、17−E2、17−E2、E3）具有较高的检出率和检出含量（表1）。雌激素检出率从大到小依次为E1＞17−E2＞17−E2＞E3＞17−EE2＞DES；E1、17−E2 和17−E2 的平均含量分别为280.94、62.02 μg·kg和72.02 μg·kg，中位值分别为95.88、10.84 μg·kg和21.45 μg·kg；E3、17−EE2 和DES 的平均含量分别为4.15、1.84 μg·kg和1.30 μg·kg，E3 的中位值低于定量限（LOQ），17−EE2和DES的中位值均为未检出（ND）。肉鸡粪便中主要以内源性雌激素E1、17−E2和17−E2为主，表明肉鸡养殖中的雌激素排放主要来源于内源性雌激素。

表1 肉鸡粪样品中6种雌激素含量（干质量，n=120）Table 1 6 estrogens content in broiler feces（dry weight，n=120）

不同研究报道的鸡粪样品中雌激素种类与浓度均差异较大（表2）。相比于其他研究，本研究样品中E1 含量远高于其他研究，17−E2 的含量水平相差较小，E3 的 含 量 水 平 与 胡 双 庆 等 的 结 果 相当，但远低于LI等的研究结果。上述差异可能是由于试验对象的品种、年龄、性别、生长阶段、作息习惯、饲料、进食量以及生长繁殖情况等不同造成的。本研究及其他学者的研究均表明鸡粪中人工合成雌激素的检出浓度与检出率较低，说明人工合成雌激素在肉鸡养殖场使用较少。

表2 不同文献报道的鸡粪中6种雌激素含量比较（μg·kg−1）Table 2 Comparison of 6 estrogens content in chicken manure reported in different literatures（μg·kg−1）

2.2 肉鸡粪便中雌激素的季节排放特征

肉鸡粪便样品中6 种雌激素的总含量由大到小依次为夏季＞秋季＞春季＞冬季（表3）。4 种内源性雌激素E1、17−E2、17−E2 和E3 在夏季具有较高的检出率和检出含量，其检出率均为100%，含量均值分别为854.91、184.87、154.53 μg·kg和9.96 μg·kg；冬季雌激素的检出率和检出含量最低，除E1 的检出率为100%外，17−E2、17−E2 和E3 分别为40%、67%和37%，含量均值分别为13.23、1.59、4.98 μg·kg和0.57 μg·kg；人工合成雌激素（17−EE2、DES）在4个季节样品中的检出率和检出含量均较低。夏、秋季样品中测得的雌激素主要以E1、17−E2 和17−E2 为主，春、冬季则主要以E1和17−E2为主。3种检出含量与检出率较高的内源性雌激素在不同季节采集的肉鸡粪便间存在明显差异（表3）。夏季肉鸡粪便中E1 含量显著高于春、秋和冬季；夏季和秋季肉鸡粪便中17−E2和17−E2的含量显著高于春季和冬季。

表3 不同季节肉鸡粪便中的雌激素含量分布（干质量，n=30）Table 3 Concentration distributions of estrogen in broiler manures in different seasons（dry weight，n=30）

有研究表明，畜禽分泌和排泄雌激素受季节性环境条件（温度、湿度、光照、气压等）变化的影响。鸡舍舒适的环境温度为18~26 ℃，夏天温度过高时，畜禽易受热应激影响而导致内分泌机能发生紊乱、能量消耗增大、新陈代谢减缓等，使得体内雌激素分泌异常，该热应激影响会持续到秋季。不同季节肉鸡排泄的雌激素量存在显著差异，在开展家禽养殖中雌激素的排放量测算时，应开展不同季节的家禽粪便中雌激素的排放特征调查，避免单次采样或某一时间段的试验导致测算结果的偏高或偏低。

2.3 试验肉鸡间雌激素含量差异性比较

为考察试验动物间雌激素排放情况的差异，使用单向方差分析（ANOVA）对5 组试验肉鸡粪便中4 种检出率较高的内源性雌激素含量结果进行差异显著性分析，结果如表4 所示。4 种目标雌激素含量的组间值均在0.35以上，即试验动物间的粪便雌激素排放含量不具有显著性差异（＞0.05），表明同批次喂养的肉鸡个体间的粪便雌激素含量总体相似，无显著差异，生长环境相同且进食相同的肉鸡在内源性雌激素排放方面的个体间差异可以忽略。

表4 肉鸡雌激素排放个体间差异分析（n=60）Table 4 Analysis of individual differences for estrogen emissions in broilers（n=60）

2.4 雌激素活性分析

雌激素活性通常可用来表征样品中总雌激素的当量（总）。试验结果表明（图1），春、夏、秋和冬季肉鸡粪样品中雌激素活性范围分别为39.27~146.30、474.88~1 080.22、180.32~378.44 μg·kg和10.80~71.66 μg·kg，平 均 值 分 别 为（76.08±9.92）、（728.19±39.52）、（243.89±21.62）μg·kg和（35.10±2.60）μg·kg。夏季鸡粪样品中的总最高，是平均含量的2.7 倍，秋季次之，冬季最低；夏季样品的总主要由E1 和17−E2 贡献，占比分别为69%和21%；秋季样品的总主要由17−E2 和E1 贡献，占比分别为55%和29%；冬季样品的总相对较低，主要由人工合成雌激素贡献，17−EE2 和DES 的占比分别为40%和23%。从4 个季节样品来看，平均总为（270.81±64.07）μg·kg，主要由E1 和17−E2 贡献，占比分别为58%和29%。虽然人工合成雌激素具有较高的雌激素活性，但本研究中鸡粪样品中的雌激素活性仍主要由内源性雌激素贡献，表明肉鸡养殖中的雌激素环境风险主要来源于内源性雌激素的排放。

图1 肉鸡粪便中6种雌激素的EEQ含量分布（干质量，n=30）Figure 1 The distribution of EEQ contents for 6 estrogens in the feces of broilers（dry weight，n=30）

2.5 肉鸡粪便中雌激素日排放量

根据本试验研究结果，该鸡场每羽肉鸡日平均产粪量为0.14 kg·d，粪便平均含水率为76.7%，参照公式（3）计算每羽肉鸡粪便中6 种雌激素日排放量，结果见表5。每羽肉鸡粪便中6种雌激素的全年日平均排放总量为43.75 μg·d，总为28.66 μg·d，高于ZHANG 等估算的（0.66~12.78 μg·d），但本研究春季和冬季的日平均排放总总量与其相近，这种差异可能是由于估算方法及基础数据差异造成的。以上结果表明估算雌激素的日均排放量应将季节性差异等环境因素考虑在内，从而使排放估算值更具代表性。

表5 肉鸡粪便中雌激素日排放量（干质量，μg·kg−1，n=30）Table 5 Daily estrogen emission in feces of broilers（dry weight，μg·kg−1，n=30）

3 结论

（1）肉鸡粪便中主要存在3 种内源性雌激素E1、17α−E2 和17β−E2，人工合成雌激素17α−EE2 和DES的检出量和检出率较低，说明肉鸡养殖中的雌激素排放主要来源于内源性雌激素。

（2）肉鸡粪便中的雌激素种类和含量在不同季节间具有显著差异，夏季普遍较高，秋季次之，冬季最低，在开展家禽养殖雌激素的排放量测算时，应开展不同季节的家禽粪便中雌激素的排放特征调查，避免单次采样或某一时间段的试验导致测算结果的偏高或偏低。

（3）同一养殖场喂养的肉鸡在内源性雌激素排放方面个体间差异不显著，每羽肉鸡每日通过鸡粪排放的6 种 雌 激 素 总 量 为43.75 μg·d，雌 二 醇 当 量 为28.66 μg·d。