沃金黑牛GPR41基因多态性及其与不同阶段生长性状的相关性分析

刘 宇，肖 成，金海国，杨少滢，缪立生，沈宏旭，曹 阳*

(1.吉林省农业科学院，长春 130000；2.农业农村部肉牛遗传育种重点实验室，长春 130000；3.延边大学农学院，吉林 延吉 133000；4.吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130000)

生长性状是重要的数量性状，能够直接反映动物某一特定阶段的生长发育情况和品种改良效果[1]，通常被用作研究本品种外貌特征和生产性能[2]，是衡量畜禽生产性能和经济效益的重要指标[3]。孤儿型G蛋白偶联受体(G protein coupled receptor 41，GPR41)，又称FFAR3，位于牛18号染色体，共编码326个氨基酸，已经被鉴定为SCFAs(短链脂肪酸)受体，主要参与SCFAs依赖性能量调节，在维持能量稳态中起不可替代作用。敲除GPR41将导致小鼠的体重和脂肪重量显著降低[4-5]。LUU等[6]研究发现，GPR41能够通过调节Th17/Treg平衡，有效治疗溃疡性结肠炎并缓解炎症反应。严康[7-9]等研究证实奶牛瘤胃上皮细胞中上调的GPR41可介导瘤胃上皮保护性免疫反应。最近的一项研究表明,GPR41能够将乳腺癌细胞表型从侵入性向非侵入性转变[10]。TANG等[11]认为GPR41可能是一种有效预防和治疗T1D的潜在靶点，调节胰岛素的分泌。

沃金黑牛适应性强、肉质细嫩、风味突出，特别是肌内脂肪含量较高，具备生产高档雪花牛肉的潜力。为了更好地优化沃金黑牛核心群体，本研究拟筛选影响沃金黑牛生长性状的分子标记，利用分子育种的方法结合常规育种手段，对其进行优选。分子育种的关键是功能基因的选择。目前，在关于牛GPR41基因的研究，主要集中在牛乳腺上皮细胞乳脂合成、牛瘤胃上皮细胞免疫反应和牛胃肠道发育等方面[12-14]，鲜有关于牛GPR41基因在生长发育方面的研究。因此，本研究通过检测不同月龄沃金黑牛(去势公牛)中GPR41基因的遗传多态性，比较不同月龄阶段中的群体间基因多态性差异，在分子水平上探讨其与生长性状是否存在关联，挖掘与沃金黑牛生长性状显著相关的遗传标记，以期促进基因标记辅助育种的应用，提高早期选择和选育的准确性，加快沃金黑牛种质资源的开发与利用。

1 材料与方法

1.1 试验动物

随机挑选健康状况良好的12月龄(35头)、18月龄(28头)沃金黑牛去势公牛为试验牛，饲养管理条件一致。

1.2 主要试剂与仪器

DNA试剂盒购自Axygen公司；超微量分光光度计Quawell-Q5000购自北京鼎盛生物技术有限责任公司；PCR仪T100购自上海伯乐生命医学产品有限公司；2×ES Taq Master Mix 购自CWBIO公司。

1.3 方法

1.3.1 沃金黑牛性能测定 参照《NY/T 2660—

2014肉牛生产性能测定技术规范》认定的操作方法对沃金黑牛(去势公牛)进行生长性状测定。测定指标包括不同阶段下的体重、体高、十字部高、体斜长、胸围、腹围、管围，以及背膘厚、眼肌面积的超声波测定指标。

1.3.2 沃金黑牛基因组DNA的提取 利用DNA试剂盒提取沃金黑牛(去势公牛)血液基因组DNA，具体操作步骤参照试剂盒说明书；利用Quawell-Q5000超微量分光光度计检测提取的DNA浓度及纯度；利用1%琼脂糖凝胶电泳检测样品完整度。

1.3.3 引物设计与合成 试验所用的GPR41基因外显子2的扩增引物序列参照同类研究[15]，委托金唯智生物科技有限公司合成，引物信息见表1。

表1 沃金黑牛GPR41基因扩增引物序列

1.3.4 普通PCR扩增 以提取的沃金黑牛(去势公牛)血液DNA为模板，对GPR41基因第二外显子进行PCR扩增。PCR反应条件为：95 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s；51.2 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，从第二步开始共32个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR扩增体系为20 μL：2×ES Taq Master Mix 10 μL，DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。

1.3.5GPR41基因多态性检测 利用1%琼脂糖凝胶电泳检测得到的PCR产物，将PCR产物送出(金唯智生物科技有限公司)进行Sanger测序；利用DNAMAN软件分析测序结果，利用Chromas软件分析测序结果峰图，根据显示的核苷酸序列和图谱寻找SNP位点。与公布序列比对，分别定义纯合基因型和杂合基因型；利用Haploview软件对GPR41基因SNPs位点进行单倍型分析。

1.3.6 沃金黑牛群体遗传结构分析 根据Sanger测序结果，计算基因频率、基因型频率。利用“牛等家养动物群体遗传分析工具V1.0”评价沃金黑牛(去势公牛)群体遗传结构，进行Hardy-Weinberg卡方适合性检验，并计算遗传杂合度(He)、遗传纯合度(Ho)、多态信息含量(PIC)和有效等位基因数(Ne)。

1.3.7 数据统计分析 采用SPSS 19.0软件one-way ANOVA程序对GPR41基因不同基因型或单倍型的生长性状进行统计分析，试验数据以平均值±标准差表示，以P<0.05为差异显著的判断标准，以P<0.01为差异极显著的判断标准。

2 结果与分析

2.1 沃金黑牛GPR41基因的PCR扩增

对GPR41基因第二外显子进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到的条带与预期片段大小相一致且特异性良好。

2.2 沃金黑牛GPR41基因多态性检测

利用DNAMAN软件对沃金黑牛(去势公牛)GPR41基因第二外显子的测序结果进行核苷酸序列比对，在编码区Chr18:46058902 bp处和Chr18:46058908 bp处发现了G/T突变(S1位点)和C/T突变(S2位点)，但氨基酸序列均未发生改变。利用Chromas软件依次比对SNP测序结果，发现GPR41基因在S1位点存在GT、TT和GG 3种基因型，S2位点存在CT、TT和CC 3种基因型(图1和图2)。

图1 GPR41基因第二外显子S1位点核苷酸序列对比结果

图2 GPR41基因第二外显子S2位点核苷酸序列对比结果

2.3 沃金黑牛GPR41基因群体遗传结构分析

由表2可知GPR41基因-S1位点GT、TT和GG基因型频率分别为50.79%、19.05%、30.16%，GT型个体数最多；G、T等位基因频率分别为55.56%和44.44%，G为优势基因。GPR41基因-S2位点CT、TT和CC基因型频率分别为52.38%、30.16%、17.46%，CT型个体数最多；C、T等位基因频率分别为43.65%和56.35%，T为优势基因。适合性卡方检验表明，S1和S2位点的基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表2 沃金黑牛GPR41 SNP位点的基因型频率和基因频率

由表3可知，GPR41基因S1、S2位点的遗传纯合度(Ho)均高于遗传杂合度(He)，说明其在沃金黑牛(去势公牛)群体中的变异较小；多态信息含量分别为0.371 9和0.371 0(0.25

表3 沃金黑牛GPR41基因SNP位点的遗传变异参数

2.4 单倍型分析

对检测到的2个SNPs位点进行连锁不平衡分析，发现S1、S2间D’=1、r2=1；S1和S2位点处于完全连锁不平衡状态，剔除频率<0.01的单个单倍型，最终得到2种有效单倍型：H1(GT)和H2(TC)，频率分别为0.563、0.437；群体内可形成3种具有统计意义的有效单倍型组合：H1H1(GG/TT)、H1H2(GT/TC)和H2H2(TT/CC)。

2.5 GPR41基因SNPs位点与沃金黑牛生长性状的相关性分析

S1、S2位点与12、18月龄沃金黑牛(去势公牛)生长性状的关联分析结果见表4。由表4可知，沃金黑牛(去势公牛)S1位点：TT基因型12月龄体斜长、18月龄背膘厚分别显著高于GG和GT基因型(P<0.05)，除腹围外，TT、GT基因型12月龄生长性状均高于GG基因型(P>0.05)，除背膘厚与眼肌面积外，GT基因型18月龄生长性状均高于TT基因型(P>0.05)；沃金黑牛(去势公牛)S2位点：CC基因型12月龄体斜长、18月龄背膘厚分别显著高于TT和CT基因型(P<0.05)，除腹围外，CT、CC基因型12月龄生长性状均高于TT基因型(P>0.05)，除体斜长、背膘厚与眼肌面积外，CT基因型18月龄生长性状均高于TT基因型(P>0.05)。

表4 GPR41基因SNPs位点不同基因型与沃金黑牛生长性状的关联分析

2.6 GPR41基因SNPs位点单倍型与沃金黑牛生长性状的相关性分析

对3种有效单倍型组合个体对应的性状进行差异显著性检验，结果见表5。由表5可知，沃金黑牛(去势公牛)H2H2单倍型的12月龄体斜长显著高于H1H1单倍型(P<0.05)，沃金黑牛(去势公牛)H2H2单倍型的18月龄背膘厚显著高于H1H2单倍型(P<0.05)。除体高、十字部高和背膘厚外，H2H2单倍型12月龄各生长性状均高于H1H1和H1H2单倍型组合(P>0.05)。除十字部高、胸围和眼肌面积外，H2H2单倍型18月龄各生长性状均高于H1H1和H1H2单倍型组合(P>0.05)。

表5 GPR41基因单倍型与沃金黑牛生长性状的关联分析

3 讨 论

目前GPR41基因的研究主要集中在凋亡[16]、神经元受体调节[17]、上皮细胞免疫调节[18]、炎症性肠病[19]、能量调节[20]等方面。ZHOU等[16]研究发现，GPR41-Gβγ-P13K/Akt通路的激活，能够有效减弱发生大脑中动脉栓塞后引起的神经元凋亡。THORBURN等[21]研究证实，短链脂肪酸SCFAs通过细胞表面G蛋白偶联受体-GPR41发出信号，激活抗炎信号级联反应，增强肠道免疫屏障功能。张明等[22]研究发现GPR41是研究肠道和T1D关系的重要媒介物。Tolhurst等人[23]研究证实，GPR41 mRNA不仅在小鼠肠道L细胞中表达，且间接促进GLP-1和PYY等促胰岛素激素的释放。XIONG等[24]研究发现,瘦素的分泌因外源性GPR41过表达而增加，因siRNA介导的GPR41的敲低而减少，GPR41的激活能够促进瘦素的释放[25]。

科学的评价群体遗传结构能够为沃金黑牛(去势公牛)优质资源群体的遗传评价和保护利用提供参考依据。本试验在沃金黑牛GPR41基因外显子2处检测到G/T和C/T突变，且纯合度均高于杂合度，多态信息含量均表现为中度多态水平，说明GPR41基因的突变位点在沃金黑牛群体中遗传均匀性较高，作为遗传标记能够提供较为可靠的遗传信息。利用差异显著性检验分析GPR41基因多态性与沃金黑牛各生长阶段生长性状的连锁关系，有利于从根本上揭示沃金黑牛生长发育规律，提高群体选育。本试验发现，GPR41基因S1、S2位点多态性与12月龄体斜长、18月龄背膘厚之间存在显著相关，说明TT和CC可能是影响沃金黑牛生长性状的潜在关键基因型。上述结果与在黄牛群体[26]和牦牛群体[15]中发现的GPR41基因多态位点与生长性状关联性研究结果相似。此外，本试验发现在沃金黑牛不同生长阶段，S1、S2位点各基因型与各生长性状的相关性并不完全一致，一方面原因可能是样本数量导致的样本统计量差异，另一方面说明沃金黑牛在不同生长阶段GPR41基因的转录表达机制可能存在差异，需进一步深入研究。

生长性状受多个SNP位点或微效基因间的相互作用而共同调控，连锁不平衡分析可以有效检验SNPs互作关系，单倍型分析可以准确研究目标性状的关联性[27]。对沃金黑牛(去势公牛)群体GPR41基因SNPs位点进行连锁不平衡及单倍型分析，有利于进一步揭示沃金黑牛表型性状的遗传信息。本研究中沃金黑牛GPR41基因S1、S2位点处于完全连锁不平衡状态，说明S1、S2位点并非处于彼此独立的状态，且趋于连锁遗传。本研究中沃金黑牛单倍型组合关联分析结果与单个SNP关联分析结果一致，其中S1位点的TT基因型、S2位点的CC基因型、单倍型组合H2H2均与沃金黑牛12月龄体斜长、18月龄背膘厚呈显著相关,进一步验证了S1和S2位点的连锁关系。

上述结果说明，本研究检测到的遗传标记在沃金黑牛品种选育过程中的可行性与稳定性，初步验证GPR41基因有望作为沃金黑牛生长性状的优良候选基因，可在各生长阶段育种工作中考虑增加GPR41基因的育种强度，从而更好地发挥沃金黑牛种质资源优势。

4 结 论

沃金黑牛(去势公牛)GPR41基因外显子2在S1、S2位点存在遗传多态性，且与沃金黑牛不同生长阶段的体斜长与背膘厚显著相关。单倍型组合H2H2与沃金黑牛不同生长阶段的体斜长与背膘厚呈显著相关，可用于沃金黑牛主要生长性状的基因标记参考、稳定与优化。但GPR41基因能否作为沃金黑牛不同生阶段生长性状的分子标记位点，以及对体重等性状的调控机制还需进一步深入研究。