血管紧张素1-7对盐敏感性高血压大鼠心脏钠泵的影响

曹 峻，姜黔峰，周 陈，何绘姗，方明亮，谷尚武

(1.遵义医科大学第三附属医院 心血管内科，贵州 遵义 563000；2.成都市第二人民医院 心血管内科，四川 成都 610017；3.播州区人民医院 心血管内科，贵州 遵义 563100)

盐敏感性高血压(SSH)是原发性高血压的类型之一，主要是由于高钠盐摄入导致血压升高[1]。研究发现上皮钠离子通道(Epithelial sodium channel，ENaC)是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)的效应器，此外它还受神经体液因子的调控，参与水盐代谢和血压的调节[2-4]。研究还发现血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ，AngⅡ)可抑制自发性高血压大鼠动脉血管平滑肌细胞膜钠泵的活性及下调mRNA的表达[3-4]。Ang1-7是肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system，RAS)中重要的活性七肽，主要由血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)水解AngⅡ得到, 生理作用主要表现为降血压、抗心肌肥厚等心脏保护作用[5]，但其具体机制尚不清楚。因此本研究以神经损伤性盐敏感性高血压大鼠为研究对象，探究Ang1-7对盐敏感高血压大鼠心肌钠泵活性、mRNA及蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级新生雄性Wistar大鼠35只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司 [合格证号：11400700045542,动物实验室许可证号：SCXK(京)2012-0001]。选取35只新生雄性Wistar大鼠在出生第1、2天分别行皮下注射辣椒辣素50 mg/kg建立感觉神经损伤性盐敏感性高血压大鼠模型[6]。经过哺乳期3周后予高盐饲料(含4%NaCl)饲养4周。后根据不同干预将大鼠随机分为7组，每组5只。正常对照组：予正常盐饲料(含0.5%NaCl)饲养；模型组：继续予高盐饲料饲养；替米沙坦组：每日上午经消化道给药，替米沙坦10 mg/(kg·d)；雷米普利组：每日上午经消化道给药，雷米普利1 mg/(kg·d)；假手术组：Alzet微渗泵入生理盐水，25 μg/(kg·h)；Ang1-7组：Alzet微渗泵入Ang1-7，25 μg/(kg·h)；A-779组:Alzet微渗泵入A-779，25 μg/(kg·h)；后各组继续予4%NaCl高盐饲料饲养。连续干预饲养4周后，麻醉取材。所有动物实验程序均经遵义医科大学动物护理和使用委员会批准。

1.1.2 仪器试剂 辣椒素、Ang1-7购自美国SIGMA公司；A- 779购自瑞士Bachem公司；替米沙坦购自上海勃林格殷格翰药业有限公司；雷米普利购自北京赛诺菲安万特制药有限公司；大鼠血管紧张素Ⅱ酶联免疫分析试剂盒、大鼠血管紧张素1-7酶联免疫分析试剂盒购自上海沪鼎生物科技有限公司；DEPC水、Trizol、逆转录试剂盒、Real-Time PCR试剂盒、β-actin引物购于宝生物(大连)工程有限公司；Na+-K+-ATPase α1亚单位单克隆抗体购自购于abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠尾动脉血压测量 采用Softron BP-98A大小鼠无创测压仪测量鼠尾动脉收缩压。自哺乳期结束(3周鼠龄)起每周固定时间测量鼠尾动脉收缩压，每次测量3次取平均值。

1.2.2 酶联免疫分析 干预结束后处死大鼠进行取材。剪取适量左心室心尖部心肌组织，清洗去除血液，匀浆取上清液，使用酶联免疫分析测定上清液中Ang1-7和AngII含量。

1.2.3 RT-PCR实验 提取大鼠左心室心尖部心肌组织总RNA,根据逆转录试剂盒(大连宝生物)将RNA逆转录合成cDNA。并在实时PCR反应中，使用大鼠特异性引物用于扩增和检测基因的表达。RT-PCR反应第一步预变性95℃ 3 min，第二步变性95℃ 10 s，退火、延伸60℃ 45 s，第二步共循环40次。引物序列如下：Na+-K+-ATPaseα1-subuni：Forward primer：5’-CTGATCAGCATGGCCTATGGAC-3’,Reverse primer：5＇-ACCGTTCTCAGCCAGAATCACA-3＇。使用2-ΔΔCT法分析数据。

1.2.4 免疫组化 取大鼠左心室心尖部组织石蜡切片，采用GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒免疫组化染色观察Na+-K+-ATPase α1亚单位在心肌组织中的分布。结果经使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行图像数据分析，通过软件计算出每张图片上阳性显色部位(棕褐色)的平均光密度(MOD)，将一张切片上3个视野图像的MOD求平均值作为该切片的MOD。

2 结果

2.1 不同干预对SSH大鼠血压的影响 未进行高盐饮食前(3周鼠龄)，各组间血压差异无统计学意义(P>0.05)。不同盐浓度饲料饲养4周后(7周鼠龄)，与模型组比较，正常对照组大鼠血压降低(P<0.05)，且与其它高盐饲养组之间差异无统计学意义(P>0.05)。当药物干预2周(9周鼠龄)及4周(11周鼠龄)，与模型组比较，正常对照组、替米沙坦组及雷米普利组血压明显降低(P<0.05)，假手术组、Ang1-7组和A-779组血压无明显差异(P>0.05)。与干预前血压比较，药物干预2周(9周鼠龄)时雷米普利组、替米沙坦组及Ang1-7组血压有所降低(P<0.05)，余各组前后血压无明显差异(P>0.05)；药物干预4周(11周鼠龄)时，雷米普利组及替米沙坦组血压下降(P<0.05)，余各组血压前后无明显差异(P>0.05，见表1)。

表1 不同干预对SSH大鼠血压的影响

2.2 不同干预对SSH大鼠心室肌组织Ang1-7和AngII水平的影响 酶联免疫分析测定结果如图1、2。与模型组比较，正常对照、Ang1-7、A-779、替米沙坦、雷米普利组心室肌组织中Ang1-7浓度增加(P<0.05)，假手术组无明显差异(P>0.05)。与Ang1-7组比较，假手术组及A-779组Ang1-7水平降低(P<0.05)，余各组无明显差异。

与模型组比较，正常对照、替米沙坦、雷米普利组心室肌AngⅡ浓度降低(P<0.05)，余各组无明显差异(P>0.05)；与Ang1-7组比较，替米沙坦组及雷米普利组含量降低(P<0.05)，余各组无明显差异(P>0.05)。

*：与Ang1-7组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05。图1 各组大鼠心肌组织Ang-(1-7)浓度

*：与Ang1-7组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05。图2 各组大鼠心肌组织Ang II浓度比较

2.3 不同干预对SSH大鼠心室肌组织Na+-K+-ATPase α1亚单位mRNA表达的影响 RT-PCR检测结果如图3。与模型组比较，正常对照组、替米沙坦组和雷米普利组及Ang1-7组大鼠心肌组织Na+-K+-ATPase α1亚单位mRNA表达量下降(P<0.05)，A-779组及假手术组无明显差异(P>0.05)。与Ang1-7组比较，A-779组及假手术组表达增高(P<0.05)，其它各组无明显差异(P>0.05)。

*：与Ang1-7组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05。 图3 各组大鼠心肌组织Na+-K+-ATPase α1亚单位mRNA相对表达量的比较

2.4 不同干预对SSH大鼠心肌组织Na+-K+-ATPase α1亚单位蛋白表达的影响 免疫组化结果如图4、5。与模型组比较，正常对照、替米沙坦、雷米普利、Ang1-7组大鼠心室肌组织中Na+-K+-ATPase α1亚单位蛋白表达量降低(P<0.05)，A-779组及假手术组无明显差异(P>0.05)。与Ang1-7组比较，A-779组及假手术组表达增高(P<0.05)，其它各组无明显差异(P>0.05)。

A：正常对照组；B：替米沙坦组；C：雷米普利组；D：模型组；E：Ang1-7组；F：假手术组；G ：A-779组；×400。图4 心肌组织Na+-K+ -ATP aseα1亚单位免疫组化染色结果

*：与Ang1-7组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05。图5 心肌组织Na+-K+ -ATP aseα1亚单位免疫组化染色结果

3 讨论

Na+- K+-ATP酶也称为钠-钾泵，简称钠泵，是由α和β两个亚单位构成，而α亚单位是其主要功能单位，是维持细胞钠离子正常水平的重要转运物质。高血压的发生受遗传和环境等因素的影响，高盐摄入是已知的环境因素之一，不同的人表现出对钠敏感的不同，一些人表现出明显的血压上升，而另一些人几乎没有变化[7]。因高钠盐摄入导致血压升高，称为盐敏感性高血压，这可能与对钠处理和排泄途径的变异有关。而上皮钠通道(ENaC)是远端肾单位Na+重吸收的关键转运体之一，该通道在调节细胞外液容量从而在调节血压方面起着重要作用[8]。在心肌细胞中，Na+-K+-ATP酶参与心肌细胞膜的去极化，并通过Na+/Ca2+交换间接参与细胞内Ca2+的调控[9-10]。近期研究发现在不同动物模型中Na+- K+-ATP酶信号的长时间激活促进了心肌成纤维细胞的增殖及增加胶原的合成[11]。还有研究发现动脉血压的盐敏感性可能与RAS系统的活动有关，RAS系统激活与活性氧类等共同参与高血压的形成，且钠盐可能进一步加强其作用[12]。Ang1-7是RAS中的重要活性肽，主要是由ACE2水解AngⅡ得到, 具有降血压、抗心肌肥厚等心脏保护作用。有研究在小鼠和大鼠的主动脉中，注射Ang 1-7非肽类Mas激动剂和肽类Mas激动剂观察到血管舒张作用，而加入A-779(一种Ang1-7拮抗剂)后其作用则被抑制或减弱[13]。因此我们以感觉神经损伤性盐敏感高血压大鼠为研究对象，探究Ang1-7对钠泵的影响。本研究结果显示，在高盐饲养4周时各组大鼠血压明显高于正常对照组，说明造模成功，符合感觉神经损伤性盐敏感高血压模型特点：正常盐饲养不会引起血压升高，而高盐会导致血压升高。有研究在Ang1-7治疗自发性高血压大鼠(SHR)中发现，Ang1-7可能通过降低心率从而控制血压、改善心脏功能，这与我们研究结果相似[14]。本研究结果显示， Ang1-7组大鼠在干预2周后血压出现下降，但下降幅度较雷米普利组、替米沙坦组弱，说明Ang1-7对该盐敏感高血压大鼠模型具有一定降压作用，但随着时干预时间延长，降压作用减弱，其可能原因为后期老鼠体重增加明显药物剂量不够所致，其具体机制还有待进一步研究。

研究发现ACE2/Ang1-7/Mas轴中，Ang1-7可激活内皮细胞上的Mas受体诱导磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B途径，激活内皮型一氧化氮合酶，释放NO并舒张血管降低血压[15-16]。而在肾脏中Ang1-7可抑制近端小管内钠的再吸收，从而增加肾脏水和钠的排泄。还有研究发现钠泵活性和α1亚基在一肾一狭窄高血压大鼠中早期明显增高，但随后逐渐降低，后期大鼠心肌细胞钠泵活性和α1亚基表达呈明显抑制状态[17]。这可能与长期高血压以及严重高血压时这种代偿性的反应消失，甚至出现泵活性及基因与蛋白表达抑制有关。本研究结果显示，在高盐饲养的盐敏感大鼠模型组较正常对照组大鼠心室肌细胞Na+- K+-ATP酶α1亚单位mRNA及蛋白的表达量明显升高，说明高盐会诱导盐敏感高血压大鼠Na+- K+-ATP酶α1亚单位的表达，其原因可能与机体为维持细胞内高钾、低钠的状态上调钠泵表达有关；而在给予雷米普利(ACEI类)、替米沙坦(ARB类)干预后心室肌中Na+- K+-ATP酶α1亚单位mRNA及蛋白表达受到抑制，与目前Patel等[18]在肥胖症大鼠研究中的发现相似， ACEI类药物或ARB类药物对血清中的Na+有下调作用。本研究同时发现Ang1-7对心室肌Na+-K+-ATP酶α1亚单位mRNA及蛋白的表达也有抑制作用，再加入拮抗剂A-779后此抑制作用减弱或逆转，提示Ang1-7对心肌钠泵存在直接的调节作用，但具体作用机制还有待进一步研究。

综上所述，Ang1-7在盐敏感高血压的发生发展中起着重要作用。高盐饮食可以诱导盐敏感性高血压大鼠心室肌细胞Na+-K+-ATP酶α1亚单位mRNA和蛋白表达升高，而Ang1-7干预后可抑制大鼠心室肌细胞Na+-K+-ATP酶α1亚单位mRNA和蛋白表达，说明Ang1-7对盐敏感大鼠心室肌钠泵存在调节作用。