LncRNA-PANDAR介导EphA2、TRPM8对OSCC细胞侵袭、迁移及凋亡的作用机制

李俊梅，丹 丹，田碧媛，张 邯，李延玲

(1.邯郸市人民医院,河北 邯郸 056001;2.邯郸市口腔医院，河北 邯郸 056001)

口腔鳞状细胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)主要发生于牙龈、硬腭、舌体、颊粘膜、嘴唇等多种器官，属于头颈部恶性程度最高、危害性最大的肿瘤，发生病例占头颈部鳞状细胞癌的50%左右[1]。根据组织来源的不同可以分为颊癌和舌癌等，其中舌癌在临床上最为常见，约占50%，其活动度较高，血运丰富，淋巴转运率有所提升，患者预后效果比较差[2]。口腔鳞癌的转移能力较强，可通过淋巴等浸润周围组织,另外它可以造成口腔功能的损失，当进一步发展时，还会导致局部溃烂，影响生活质量，危害到患者的生命[3-4]。有关研究表明长链非编码RNA(LncRNA)对癌细胞生物学行为具有一定的影响，LncRNA-PANDAR是其成员之一，定位于第6号染色体上，其长度约为 1 500 bp，研究发现它能够调控多种基因表达[5]。Eph受体酪氨酸激酶A2(Phospho Tyr930，EphA2)是从人上皮角化细胞模板DNA文库中筛选得到的一个Eph亚家族成员，有研究发现，在癌细胞中活化的内生型EphA2与其配体结合，起到抑制细胞黏附作用，并导致局部黏着斑激酶(Focal adhesion kinase，FAK)磷酸化水平发生改变，影响细胞生物学行为[6-7]。另有研究发现，该离子通道瞬时受体电位(Transient receptor potential，TRP)通过介导钙离子贯穿肿瘤的始终，TRPM是其亚族，已有研究表明其参与肿瘤产生及发展过程，TRPM8是其成员之一；研究表明EphA2与TRPM8在膀胱癌中为低表达呈正相关关系，miR-21通过抑制EphA2、TRPM8水平可抑制癌细胞侵袭[8]；已有研究提示，LncRNA-PANDAR可通过调控基因水平发挥抑癌作用，但目前关于LncRNA-PANDAR对EphA2、TRPM8影响的相关文献较少，具体作用机制尚未完全清楚[9]。因此本文研究LncRNA-PANDAR通过靶向降低EphA2、TRPM8活性从而抑制口腔鳞癌细胞的迁移、侵袭，促进其凋亡。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 人OSCC 细胞系(SCC6、SCC9、SCC25)和正常人口腔角质形成细胞(HOK)来自上海子实公司，于实验室保存。青霉素(山东康迪公司)、胰酶(江西百盈公司)、结晶紫溶液(上海如吉公司)、流式细胞仪(河北慧采公司)、链霉素(广州利晟通公司)、裂解液(福州奥研公司)、酶标仪(济南欧莱博公司)。

1.2 细胞培养 将SCC6、SCC9、SCC25细胞用含1×105U/L青霉素、0.1 g/L链霉素、5 μmol/LPTX 培养液常规培养，细胞数为80%～90%时胰酶消化，离心，1 250 r/min，共5 min，重悬，传代，取第四代细胞进行实验。

1.3 细胞转染及分组 选取PANDAR表达最高的SCC25细胞接种于6孔板中，生长至75 %上下时，按照Lipofectamine 3000的说明转染适量的siRNA及相应的对照siRNA。6～8 h后换液，培养48 h后收集细胞并保存备用。实验分为口腔癌组(癌细胞未处理)、对照组(转染不相关序列组)、转染组(转染PANDAR组)。

1.4 RT-PCR检测PANDAR mRNA水平 取SCC6、SCC9、SCC25细胞及HOK细胞，研磨,用Trizol进行总RNA的提取,进行逆转录,将逆转后所得的cDNA进行荧光反应实验。内参为GAPDH，变性2 min 95 ℃,变性5 s 95 ℃；30 s 60 ℃；30 s 70 ℃进行45次。计算方法用2-△△Ct法进行分析，见表1。

表1 引物序列

1.5 Transwell小室检测侵袭能力 于6孔板中接种SCC25细胞，将50 mg/L的基质胶稀释加入小室上层，37 ℃下呈凝胶状态，上室加细胞悬液，下室加胎牛血清培养基，37.5 ℃，培养2 d，取出培养基，拭去残留细胞，现配结晶紫，每孔500 μL，将小室放入，25 ℃染色30 min，PBS清洗，稍晾干。显微镜观察每个样本连续选5清晰视野进行数量统计，然后计算器平均数。

1.6 Transwell法检测迁移能力 取各组SCC25细胞无血清培养基饥饿细胞12 h，后调整为5×105个细胞/mL，Transwell 小室下室加入培养基，上室加入细胞悬液，常温培养16 h，甲醛固定，结晶紫溶液(0.1%)染色，将膜上室面细胞擦拭掉后观察、拍照。实验重复3次。

1.7 流式细胞仪测凋亡 将0.25%蛋白酶消化的各组SCC25细胞，接种到无牛血清培养基过夜，24 h后，收集细胞每组选择3个样本，PBS洗涤1次，100 μL接种于5 mL流式试管中，5 μL的IFITC AnnexinⅤ与5 μL PI 混合后染色，无光孵育15 min后注入400 μL 结合缓冲液混匀，清洗，流式细胞仪测凋亡率。

1.8 Western blot检测EphA2、TRPM8、FAK水平 取各组SCC25细胞，裂解液裂解并提取蛋白,并对蛋白的浓度进行测量,分装后,保存在零下20oC的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液进行混均,然后将其煮沸、变性、电泳，后移至PVDF膜上,加脱脂奶粉封闭1 h。加入EphA2、TRPM8、FAK1抗(1∶150稀释)4oC度孵育过夜，加入2抗(1∶2 000稀释),常温封闭1 h。取出PVDF膜,漂洗，DAB显色后照相。

1.9 双荧光素酶报告基因 将融合至80%的SCC25细胞接种于6孔板中，按照LipofectamineTM2000说明将EphA2-3′-UTR-WT、EphA2-3′-UTR-MUT，TRPM8-3′-UTR-WT、TRPM8-3′-UTR-MUT质粒转染HOXB5-NC(NC组)，LncRNA-PANDAR mimics(LncRNA-PANDAR组)共转染至细胞，严格按照说明检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 PANDAR水平检测结果 各口腔鳞癌细胞中PANDAR mRNA表达水平较HOK组细胞低(P<0.05)，SCC25组中PANDAR表达水平高于其他口腔鳞癌细胞(P<0.05)，因此本文后续实验选用SCC25细胞进行，其余细胞暂未进行实验(见图1)。

*：与HOK组比较,P<0.05；a：与SCC6组比较,P<0.05；b：与SCC9组比较,P<0.05。图1 PANDAR在各细胞中的表达

PANDAR mRNA在口腔癌中与对照组中表达水平接近，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，转染组中PANDAR mRNA水平较对照组低(P<0.05)，表明转染成功(见图2)。

*：与口腔癌组比较P<0.05；#：与对照组比较，P<0.05。图2 PANDAR在细胞中的相对表达量

2.2 侵袭能力检测结果 口腔癌组细胞侵袭数量为(812.45±45.22)，与对照组(794.31±47.33)相比差异无统计学意义(P=0.512)；转染组细胞侵袭数量(432.56±22.15)低于对照组(P<0.001)，见图3。

A：口腔癌组；B：对照组；C：转染组。图3 各组细胞侵袭能力对比(×400)

2.3 迁移能力检测结果 口腔癌组细胞迁移数量(843.26±65.21)与对照组(812.37±67.13)数量接近，组间比较差异无统计学意义(P=0.443)；转染组细胞迁移数量(569.43±42.36)低于对照组(P<0.001)，见图4。

A：口腔癌组；B：对照组；C：转染组。图4 各组细胞迁移能力对比(×400)

2.4 细胞凋亡检测结果 口腔癌组细胞凋亡率(9.12±1.03)%与对照组细胞凋亡率(8.94±1.05)%相比，组间差异无统计学意义(P=0.775)；转染组细胞凋亡率(23.52±0.37)%低于对照组(P<0.001，见图5)。

图5 各组癌细胞凋亡情况对比

2.5 EphA2、TRPM8、FAK水平检测结果 口腔癌组EphA2、TRPM8、FAK蛋白表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，转染组EphA2、TRPM8、FAK蛋白表达水平较对照组低(P<0.05)，见表2、图6。

表2 各组EphA2、TRPM8、FAK水平对比

*：与口腔癌组比较，P<0.05；#：与对照组比较，P<0.05。图6 各组细胞中EphA2、TRPM8、FAK蛋白的表达

2.6 双荧光素酶报告 转染LncRNA-PANDAR后EphA2、TRPM8及FAK野生型活性下降(P<0.05)，对突变基因无影响(P>0.05)，表明EphA2、TRPM8及FAK是LncRNA-PANDAR的靶基因(见表4)。

表4 双荧光素酶报告

3 讨论

口腔鳞状细胞癌易出现远处转移，如肺转移、骨转移、血运转移等，造成口腔功能损失，如长在舌头上可影响语言、吞咽功能，进一步发展时，可引起恶臭或者是远处转移，导致局部溃烂，危害患者生命。口腔鳞状细胞癌组织发生部位相对特殊，恶性程度高，浸润性强，易发生区域淋巴结转移或远处转移，且预后较差。吸烟、饮酒、无烟烟草以及人乳头瘤病毒感染均是诱发口腔鳞状细胞癌的危险因素。有关研究提出LncRNA-PANDAR、EphA2、TRPM8均可调控细胞的生物学行为，因此本文研究LncRNA-PANDAR、EphA2、TRPM8水平对口腔鳞状细胞癌生物学行为的作用，具体分析如下。

相关研究表明，lncRNA 可调控多种肿瘤细胞的生物学行为，与多种肿瘤的产生及发展具有一定的相关性[10]。各口腔鳞癌细胞中PANDARmRNA表达水平较HOK组细胞低，PANDAR具有转录调控基因水平的能力，其还具有组织特异性，在疾病中具有较高的诊断敏感性[11]。本文PANDAR 在口腔鳞癌中的表达及功能进一步研究后发现，经过转染PANDAR抑制剂后，口腔鳞癌的侵袭、迁移、凋亡均发生改变，说明LncRNA-PANDAR可抑制口腔鳞癌细胞的生物活性。殷生良等[12]表明抑制Lncrna-PANDA表达可加快骨肉瘤细胞的凋亡。张超等[13]表明抑制Lncrna-PANDA水平可抑制甲状腺癌细胞的增殖及转移。聂军等[14]对非小细胞肺癌的研究中提出，LncRNA-PANDAR在癌组织中的表达低于癌旁组织。方松城等[15]对舌癌的研究中提出，LncRNA-PANDAR在舌癌中为高表达，降低其表达可加快癌细胞凋亡。本文研究与上述医学者研究结果相一致。

肿瘤的产生与发展是一个复杂的、多样化的过程。TRP是肿瘤恶化的重要通道，通过调控钙离子而加快癌细胞增殖。TRPM8是最新发现的前列腺特异性基因，在前列腺癌与口腔癌中的表达均显著高于正常组织[16]。RTK(受体酪氨酸激酶)贯穿肿瘤产生与发展的全过程，对细胞生物学行为具有调控的作用[17]。Eph家族是RTK家族成员之一，Eph受体家族又分为EphA、EphB两种。EphA2可调控癌细胞的增殖及迁移，并在血管的产生中也存在着一定的作用[18]。EphA2在结肠癌、食管癌等多种癌细胞中均未高表达[19-20]。FAK参与黏着斑的形成。当黏附分子整合素与其配体或生长因子与其受体结合时，将会激活FAK，介导细胞增殖及凋亡信号[21-22]。相关研究表明，癌细胞外基质蛋白含量较多，可促进整合素与其结合并激活FAK，并与酪氨酸激酶结合，介导存活信号，促进癌细胞增殖，以及加快血管新生[23]。经本文研究发现，EphA2、TRPM8、FAK表达水平在经过LncRNA-PANDAR干预后有所降低。曾宁碧等[24]表明TRPM8在口腔鳞癌中为高表达。陈昌伟等[25]对口腔鳞癌的研究中提出，EphA2、FAK具有正相关关系，且FAK受EphA2调控是其下游靶基因，通过调控FAK从而影响细胞的生物学行为及粘附作用。王亚辉等[26]对膀胱癌的研究中提出，EphA2、TRPM8为正相关关系。本文研究结果与上述医学者研究结果相似，因此本文认为，经过LncRNA-PANDAR干预后，通过降低EphA2、TRPM8水平，进而抑制癌细胞的迁移、侵袭能力，促进凋亡，本文通过荧光素酶报告结果显示转染LncRNA-PANDAR后EphA2、TRPM8及FAK野生型活性下降，对突变基因无影响，表明LncRNA-PANDAR可靶向EphA2、TRPM8及FAK基因。

综上所述，LncRNA-PANDAR通过靶向降低EphA2、TRPM8活性从而抑制口腔鳞癌细胞的迁移、侵袭，促进其凋亡。