根结线虫分类鉴定的原理和方法

2022-03-16杜宾

太原学院学报(自然科学版) 2022年1期

杜宾

(太原学院艺术设计系，山西太原 030032)

0 引言

线虫(Nematode)广泛分布于整个生态系统中，它可分为植物寄生线虫、动物寄生线虫和自由生活线虫，其中植物寄生线虫是专性寄生在植物体上，严重破坏植物生长发育的病原线虫。全世界植物寄生线虫正式报道有200余属5 000余种[1]。它们成为危害人类农业生产、林业生产、蔬菜种植、食品加工安全的重要的致病因子，每年造成的损失高达1 500亿美元，直接影响农林业生产的可持续发展。其中，根结线虫造成的损失占到全部损失的50%以上，常常造成毁灭性的危害[2]。

1 根结线虫的危害和种类

根结线虫隶属于线虫门(Nematoda)，侧尾腺纲(Secernentea)，垫刃目(Tylenchida)，异皮科(Heteroderidae)，根结线虫属(Meloidogyne)。该虫虫体细小，是一种寄主高度专化、食性广泛、多杂的植物病原物，寄生于植物根部，诱导根系细胞代谢紊乱，形成巨型细胞，呈现根结或根瘤状态，危害根部维管束组织，使植物快速死亡[3]。

全世界报道的根结线虫共有90多种，我国报道的记录有57种，其中南方根结线虫(M.incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(M.javanica)和北方根结线虫(M.hapla)最为常见，并且危害严重，为传统意义上的4个主要代表类群。除此以外，危害严重的根结线虫种类还有法拉克斯根结线虫(M.fallax)、纳西根结线虫(M.naasi)和奇特伍德根结线虫(M.chitwoodi)。

2 根结线虫分类鉴定的方法

根结线虫分类方法包括形态学(测量值)鉴定和分子生物学(DNA-PCR)鉴定两个方面。形态学鉴定方法主要有根结线虫外部形态学特征和测量值法、辅助鉴别寄主实验法、生物化学方法(同工酶电泳技术、细胞遗传学技术)等。分子生物学鉴定主要依据现代分子生物学技术和方法，通过分析核酸DNA、线粒体DNA等生物大分子的不同，直接检测根结线虫种群之间和种群内部、群体间在生物遗传物质组成上的特有差异，从而鉴别其种类。根结线虫基因组小，只有5.1×107个碱基对，DNA分析种内及种间的遗传变异相对容易，因此随着分子生物学的发展，DNA分析技术已经成为形态学鉴定的一个重要的不可或缺的辅助手段，使根结线虫的鉴定更加准确快速。目前利用分子生物学鉴定根结线虫的方法主要有ITS-PCR分析、RFLP分析、RAPD分析、ALFP分析和PCR-RFLP分析。我国系统研究根结线虫的分类开始于2000年，短短20年时间，取得突飞猛进的成效。结合联用不同的鉴定方法，精准识别、鉴定不同的根结线虫种类，为进一步研究其病害奠定基础。

2.1 形态学特征鉴定

形态学特征是根结线虫鉴定的基础和依据，例如Chitwood提出雌虫的会阴花纹的重要性。早期的根结线虫分类都以其形态学特征和相关测量值相结合方式确定其分类学地位，形态学特征将一直作为线虫分类的关键性状指标。根结线虫形态学鉴定分类主要依据外部形态特征和内部结构特点，前者包括根结线虫的虫体形态、尾部特征(透明尾长度、比例等)、中食道球结构和形状、背食道腺开口到口针基球的测量距离(DGO)、排泄孔位置、雌虫会阴花纹模式、雄虫和二龄幼虫头部框架结构、口针状态等；后者包括生殖系统和消化系统的解剖显微结构等。根据Hirschmann对线虫形态学鉴定的论述，雌虫、雄虫和二龄幼虫是其鉴定的主要3个虫态，由于其它虫态外部形态的不稳定性，失去鉴定价值。在某些种类的根结线虫中，由于缺乏雄虫或雄虫数量极少，并且雌虫和二龄幼虫的形态特征十分明显，通过雌虫和二龄幼虫即可鉴定其种类。成熟雌虫形态是卵圆形到鸭梨形，但是由于受到生活环境的影响、生殖时期、虫态发育等各种因素，雌虫的体型变化很大，在种类鉴定中，雌虫虫体形态只是起到辅助作用，前段的颈的长短也具有多样性，整体上有大致范围，例如爪哇根结线虫通常比北方根结线虫长，但是具体种类间变异很大[4]。颈部前端的口针是种类鉴定的主要指标之一，口针的形态是从质的方面对其分析鉴定，主要包括锥体、基杆和基球的结构状态，尤其是口针基部球的高宽值、各部位的连接情况等。口针长度测量值是从量的方面对其种类的分析鉴定。DGO值在根结线虫种间的变化差异明显，通常为分类鉴定的重要指标。雌虫的头冠和头区特征、中食道球形态测量数值、排泄孔的位置等由于受外界条件影响大，变异性大，在鉴定中具有一定的价值。雌虫尾部的肛门、阴门及其周围的会阴花纹一般不受外界因素所影响，形态结构很稳定，尤其在种间，会阴花纹的特征是固定的，不会出现其它种类的特征变化。识别会阴花纹主要从其形状、测线、刻点、侧翼，阴门位置、肛门位置，阴门与肛门的距离等方面分析鉴定。根结线虫会阴花纹结构特征和测量数值是其形态学分类鉴定中最重要的指标[5]。二龄幼虫虫体变化很大，侧区和半月体结构等特征在种的分类中几乎没有作用。头部的形状有圆形和方形的区别，在头区有无环纹也是鉴定种类的依据之一。二龄幼虫口针的特点、长度和尾部的测量数值，包括透明尾部的特征和测量值都是重要的鉴定依据。雄虫头冠的形态、结构和DGO值具有较大的鉴定价值，其它形态结构变异性大，鉴定价值有限[6]。

2.2 鉴别寄主实验鉴定

该方法以形态学测量结果为基础，对南方、花生、爪哇和北方根结线虫准确区别的方法，不能应用于混合侵染的线虫病原鉴定。通过6种国际通用鉴别寄主接种实验，将4种常见根结线虫区分开，鉴定到种和生理小种。由于此种鉴定方法条件严格、操作时间长，只能鉴定常见的4种根结线虫，并且还必须与形态学特征鉴定相结合。另外，根结线虫种间、种内变异差别大的实际情况，经过后期实践应用，局限性很大，鉴定价值低，被其它鉴定方法代替。

2.3 生物化学方法鉴定

根结线虫早期的生物化学鉴定方法根据线虫体内不同蛋白质在聚丙烯胺凝胶板上移动的距离不同，区分不同的根结线虫种类。一般把线虫放到缓冲液中充分研磨，提取物放到电泳仪中，以溴苯酚蓝作为对照，观察实验结果，确定根结线虫的种类。双向电泳实验研究线虫体内可溶性蛋白质的总体差异，确定北方根结线虫和伪根结线虫属于不同的生物群体[7]。该方法主要有同工酶技术、细胞遗传鉴定等，同工酶鉴定技术利用酯酶、苹果酸脱氢酶等的同工酶谱，区分根结线虫种类，其表型稳定，不受环境条件、寄主植物的影响，并且4种常见根结线虫的酯酶表型区别很大，易于区分[8]。Dickson研究团队在1971年成功将同工酶技术应用到根结线虫的分类鉴定，而且根据酯酶表型绘制遗传进化树状图[9]。Hussey发现苹果酸脱氢酶可以区分南方和花生两种根结线虫种类[10]。Esbenshade团队系统研究酯酶谱在根结线虫分类鉴定中的作用，指出“酯酶是根结线虫分类中最具有鉴定价值的同工酶”，并且以酯酶谱为基础，构建根结线虫系统发育树[11]。Almeida利用同工酶技术鉴定出80多个根结线虫，促进了根结线虫分类学的发展[12]。同一时期，我国线虫科学家同样利用同工酶技术鉴定根结线虫种类，中国林业科学院的杨宝君利用同工酶技术鉴定全国采集的15种根结线虫，并且确定在广东、海南岛发现新的种类象耳豆根结线虫[13]。云南农业大学的喻盛甫、陈永芳等利用同工酶技术快速鉴定危害烟草和一串红的各种根结线虫，确定爪哇根结线虫是云南省烟草和花卉根结线虫病害的主要危害种群[14]。细胞遗传鉴定技术是从细胞遗传特征入手，通过显微镜观察，研究根结线虫不同种群个体细胞内遗传物质染色体的不同，区分根结线虫种类的方法。通过细胞固定、染色、观察，分析染色体数目，描述其形态，提供分类的依据，从而鉴定不同的根结线虫种类。由于根结线虫的生殖方式复杂，变异性大，相同种类根结线虫也同时具有多种生殖方式，有些时候，在不同生殖时间或环境下，相同个体的生殖方式都有不同的情况。另外，细胞遗传学方法操作困难，技术要求高，所以此种鉴定方法在根结线虫分类中应用范围较小。

2.4 分子生物学鉴定

根结线虫传统的鉴定方法不能完整地反映生物体遗传的本质信息，存在其自身的局限性，即便是经典的形态学特征和测量值相结合的鉴定技术，也存在一定缺陷，寄主和生活环境的变化对根结线虫的形态特征会产生差异性影响，使线虫性状表现不稳定，鉴定出现偏差；有些根结线虫种间形态学测量值有重叠现象，干扰鉴定过程和结果。近几年，随着分子生物学技术在线虫分类学科中的应用和发展，快速、准确的分子分类技术成为根结线虫种类鉴定的常规手段，由于分子生物学鉴定技术不受寄主、线虫虫态和环境条件的影响，能直接稳定地反映根结线虫的遗传信息，越来越多的线虫分类学家开始重视分子生物学鉴定技术。

现代根结线虫鉴定主要基于线虫基因组(DNA)差异和聚合酶链式反应(PCR)技术。通常采用以线虫DNA为基础的鉴定方法，DNA可以从很少的样本甚至是一条线虫个体中提取，并且根结线虫的DNA不会随着外界环境条件、食物资源或其它因素的影响而发生变化，并且分子生物学的快速发展，技术的变革创新，从遗传物质本身研究根结线虫的分类成为可能。DNA鉴定技术具有快速、可靠、准确的优势，迅速成为根结线虫鉴定的主要手段和方法。目前用于根结线虫分类的靶标基因主要是线粒体基因(mtDNA)和核糖体基因(rDNA)。根结线虫mtDNA是双链、环状分子，碱基数比核基因组少，并且更新速率快，其中细胞色素氧化酶的基因(COI—COⅢ)可以被用于根结线虫分类学、进化学研究。Power and Harris通过细胞色素氧化酶基因COⅡ区分4种常见根结线虫和奇氏根结线虫[15]，刘乐乐基于线粒体Nad5基因序列建立了3种常见根结线虫检测技术[16]，廖金玲应用mtDNA鉴定出番禺根结线虫，Blok通过mtDNA的COⅡ基因确定出象耳豆根结线虫[17]。核糖体rDNA以基因簇为单位通过重复连接方式排列，形成6个结构部分，依次是外转录间隔ETS区、18S基因区、内转录间隔ITS1区、5.8S基因区、内转录间隔ITS2区、基因间隔IGS区。核糖体中的ITS区是真核生物鉴定常用的靶标基因，由于ITS区基因进化速率快，在不同种间变异性大，对ITS区特异性扩展，比对序列，分析种间差异，常用在根结线虫种的鉴定和分类[18]。Zijlstra利用ITS区基因鉴定出形态学上十分相似的北方根结线虫、奇氏根结线虫和伪根结线虫。5.8S区、18S区、28S区和IGS区基因比ITS区基因序列保守，更加适合于根结线虫亲缘关系分析和生物进化程度的研究。Niu基于5S区和IGS区序列差异，设计象耳豆根结线虫的检测方法[19]，林宇研究28S(D2/D3)区、18S区和ITS区序列分别作为根结线虫分类鉴定条形码标记序列，结果表明28S(D2/D3)区序列具有一定的物种识别率和遗传距离间隔，可以作为根结线虫鉴定条形码的基本标记序列[20]。

根结线虫各类分子鉴定技术都是从聚合酶链式反应(PCR)的理论基础上衍生出来的，主要方法有：限制性片段长度多态性技术(RFLP)、实时荧光定量PCR技术(QPCR)、环介导等温扩增技术(LAMP)、DNA条形码分析技术(DNA barcoding)、随机扩增多态性DNA技术(RAPD)等。RFLP技术(restriction fragment length polymorphism)是用限制性酶特异性内切DNA序列，不同种类根结线虫的DNA碱基组成和序列必定存在差异，其被限制性酶切后的片段数量和碱基长度不同，从而鉴定生物种类。Power利用RFLP技术区分常见根结线虫，并且鉴定出奇氏根结线虫(M.chitwoodi)[21]。在某些线虫分类鉴定中，通过先扩增ITS区域，获得各种根结线虫的ITS-RFLP谱图，例如应用于短体线虫种类鉴定。根结线虫的ITS区基因差异大，此方法不能准确揭示根结线虫系统发育的关系。QPCR技术(real-time Quantitative PCR)是将荧光基团与PCR反应、根结线虫DNA扩增产物关联，从物质量的层面研究PCR反应过程。此方法检测时间短、结果准确，但是操作困难，技术要求较高。LAMP技术(loop mediated isothermal amplification)是在恒温条件(60 ℃)下的DNA扩增。两对内外引物在目标序列不同的位点同时扩增，增强其特异性。并且此种DNA扩增技术的检测不需要电泳检测和PCR仪器等，通过添加染料的方式直接观察，但是引物设计困难、要求高，只能扩增500 BP左右的短DNA序列。目前，此方法在根结线虫的鉴定中应用并不广泛，有待发展。DNA barcoding 是选取DNA标记物，通过PCR扩增、比对，区分不同的根结线虫种类。标准DNA的选择和应用要求片段短小，方便扩增，两端有保守性强的特异序列段，具有显著的种间差异。mtDNA中的mtCOI基因常用作DNA条形码。目前线虫DNA条形码mtCOI基因只局限于海洋自由线虫的鉴定分类。植物线虫的DNA条形码鉴定技术需要进一步研究。RAPD技术(random amplified polymorphic DNA)操作简单快捷、结果灵敏度高、多态性明显、样本DNA需要量少，因此RAPD广泛应用于物种种群确定、遗传图谱绘制、亲缘关系分析、线虫种类鉴定和系统进化发育研究。蒋寒利用RAPD-PCR技术分析4种常见根结线虫的亲缘关系[22]，吴篆芳设计、优化RAPD-PCR体系用于南方根结线虫不同居群间的遗传多样性和亲缘关系分析[23]，白万明运用RAPD-PCR技术鉴定南方根结线虫等常见线虫的种类[24]。

3 讨论

虽然现代分子生物学鉴定技术具有诸多优点，但是其并不能完全代替传统的形态学鉴定方法，在根结线虫鉴定的时候，形态学特征和相关测量数据仍然是分类的基础，简单依据基因序列作出主观判断是不正确的鉴定方式。充分发挥形态学鉴定和分子生物学鉴定各自的优势，将两者相互结合、相互参考、取长补短，才能得出更准确的鉴定结果。