四川省九龙县牦牛无形体病的调查
2022-03-16肖启程何勤欣叶兵兵
肖启程，何勤欣，石 兰，叶兵兵，涂 蕊
（1.四川民族学院 农学院，四川 康定 626000；2.四川省丹巴县格宗乡政府，四川 丹巴 626300）
牛无形体病是一种由蜱虫叮咬宿主皮肤较薄处并吸食血液引起的寄生虫疾病，急性发病时可导致动物死亡，流行比较广泛，全国各地均有发生。该病易在牛、羊等哺乳动物体内传播，也可感染人，尤其易感染放牧畜群，是一种人畜共患的自然疫源性疾病[1]。主要临床症状表现为发热、消瘦、食欲缺乏、体重减轻及内脏器官功能受损等[2]。牦牛极易成为该病易感动物。
九龙县位于四川省西部、甘孜藏族自治州东南部，地处攀西高原和青藏高原交界处，平均海拔3 000～4 000 m，植被丰富，日照充足，动物种类众多，其中最出名的经济动物为九龙牦牛，是甘孜州农业发展的特色动物，兼具使用价值和经济价值。九龙牦牛在当地以散养、放牧为主，由于牧民驱虫意识淡薄，寄生虫病时有发生。据报道，我国中南部、西南部、东北，台湾及四川松潘县、石渠县等地均已发现牛无形体病[2-6]。为研究九龙牦牛是否感染该病，本研究采用PCR法对29份牦牛血液样本进行检测，以期为当地牛无形体病的控制和预防提供流行病学依据。
1 材料与方法
1.1 样本采集
2021年7月从甘孜藏族自治州九龙县汤古镇（15头）和呷尔镇（14头）使用一次性无菌静脉采血针和无菌EDTA抗凝管采集29头牦牛颈静脉血液保存于EDTA抗凝管中，并分别编号置于4℃采样箱运回实验室低温保存待检。
1.2 试剂与设备
血液基因组DNA提取试剂盒、2*Taq PCR Master Mix聚合酶、DL2000 DNA Marker，均购买于天根生化科技（北京）有限公司。紫外凝胶成像仪（Syngene 1467），PCR扩增仪（伯乐S1000），水平电泳槽（JY-SPFT型）。
1.3 引物合成
牛无形体和中央无形体16S rRNA特异性引物，及嗜吞噬细胞无形体引物均来源于文献[7]，见表1。提交引物序列至成都擎科梓熙生物技术有限公司合成PCR特异性扩增引物。
表1 3种无形体特异性引物序列
1.4 血样DNA提取
根据产品说明书按步骤采用血液基因组DNA提取试剂盒抽提29份牦牛全血基因组DNA，于-20 ℃保存备用。
1.5 PCR检测
采用巢式PCR法分别对3种牛无形体进行扩增，所有引物扩增均采用25 μl体系，即模板2 μl，2×Taq PCR Mastermix 12.5 μl，上下游引物各1 μl，ddH2O 8.5μl。其中中央无形体上游引物为AC1F，下游引物为AC1R，牛无形体上游引物为AB1F，下游引物为AB2R，扩增条件均为变性95 ℃ 1 min，退火58 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，40个循环。嗜吞噬细胞无形体第一轮上游引物为Eh-out1，下游引物为Eh-out2，第二轮上游引物为HGA1，下游引物为HGA2，扩增条件为变性95 ℃ 1 min，退火55 ℃ 1 min，72 ℃延伸1 min，40个循环。PCR扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，并经紫外凝胶成像仪分析扩增结果，双向测通后，在NCBI中经Blast比对，并统计牦牛无形体病的感染率。
2 结果
本试验共采集九龙县29份牦牛血液样本，提取DNA后通过巢式PCR法分别扩增3种无形体目的基因，牛无形体扩增结果见图1，中央无形体扩增结果见图2，嗜吞噬细胞无形体扩增结果见图3。共检出阳性样品20份，总阳性率为68.97%（20/29），牛无形体、中央无形体和嗜吞噬细胞无形体的感染率分别为48.28%（14/29）、20.69%（6/29）、20.69%（6/29），见表2。29份样本中仅存在一种无形体的感染率为51.72%（15/29），两种无形体交叉感染率为13.79%（4/29），三种无形体同时存在的感染率为3.45%（1/29）。由此可见，该地牦牛无形体病的感染存在交叉类型，应引起高度重视。
图1 牦牛血DNA样本牛无形体扩增结果电泳图
图2 牦牛血DNA样本中央无形体扩增结果电泳图
图3 牦牛血DNA样本嗜吞噬细胞无形体扩增结果电泳图
表2 3种无形体感染情况表
3 讨论
据了解，全国牛无形体病的感染报道较多，沈雪鹰等[5]通过PCR方法检测云南省腾冲市331份牛血液样本，阳性率为42.6%；姚明国等[8]检测云南西北部555份牛血液样本，阳性率为41.08%；孙明等[9]通过相关试验发现甘肃省河西走廊牦牛血液样本无形体感染率仅为4.6%，这些结果均低于本试验调查结果。九龙县牦牛无形体病的高感染率，一方面，与当地对无形体病的认识和了解不足，养殖方式不科学及预防控制意识淡薄有密切联系，且当地养殖以散养为主，若不及时进行驱虫，极易通过蜱虫叮咬传播，引起牦牛无形体病的高感染情况；另一方面，可能由于血液样本数量较少，取样代表性不足，对结果造成影响，建议在以后的科学研究中做出合理安排，增加采样量及样本采集的科学性，尽可能地减少试验的系统误差。
此外，牦牛不仅能感染牛无形体、嗜吞噬细胞无形体和中央无形体，还可感染羊无形体。目前已证实嗜吞噬细胞无形体和羊无形体能感染人，引起与动物无形体病类似的症状[8]。本研究发现四川省甘孜藏族自治州九龙县牦牛存在牛无形体病的感染，且存在交叉感染的情况，嗜吞噬细胞无形体感染率达20.69%，表明当地可能存在人感染无形体病的情况，应引起足够重视。牦牛无形体病除了对牦牛养殖业造成直接经济损失，也会降低肉类品质和奶产量，影响其经济价值，甚至会危及人类及其他动物的健康。因此，应广泛宣传，提高个人的认知与防护意识，及时接种免疫，增强易感动物机体免疫力。同时，切断传播途径，在推进养殖业发展的同时保障人类健康。
4 结论
本研究通过巢式PCR法调查四川省甘孜藏族自治州九龙县牦牛29份血液样本牛无形体病流行情况，结果表明该地牦牛无形体病感染率为68.97%，且存在人类易感的嗜吞噬细胞无形体，应加强对该病的预防、控制和宣传，从而保障人和动物的健康。
