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miR-483-3p靶向APPL1对脂多糖诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响

2022-03-16于智轩高映春

河北医药 2022年3期
关键词:肺泡脓毒症氧化应激

于智轩 高映春

脓毒症是机体对感染的反应失控导致的危及生命健康的器官功能障碍,其病程发展迅速,具有较高的死亡率[1]。肺脏是脓毒症发生发展时容易受累的器官,严重时可并发急性呼吸窘迫综合征。Ⅱ型肺泡上皮细胞具有分裂增殖能力,参与受损肺泡上皮的修复,维持其完整性[2]。Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤是脓毒症肺损伤的细胞学基础,有效降低或修复Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤是治疗脓毒症的关键。微小RNA(miRNA)是一类参与细胞凋亡和炎性反应等生理或病理过程的小分子非编码RNA,在脓毒症的发生发展中起重要作用[3,4]。研究显示,miR-483-3p在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠和高糖诱导的心肌细胞中表达上调,过表达miR-483-3p通过转录抑制胰岛素生长因子1加剧心肌细胞凋亡[5]。StarBase生物信息学软件预测显示,磷酸酪氨酸衔接蛋白1(APPL1)可能是miR-483-3p的靶基因。APPL1是与脂联素受体直接结合的衔接蛋白,参与细胞增殖、介导胰岛素信号传递、胞内运输等生理过程。研究显示,过表达APPL1可降低脂多糖(LPS)诱导的心肌细胞氧化损伤和凋亡,减轻LPS诱导的心肌细胞损伤[6]。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,可诱导肺泡细胞损伤。因此,本研究观察miR-483-3p对Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响及其能否通过调控APPL1影响Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤,以期为脓毒症急性肺损伤的靶向分子治疗提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞,北京派瑞金生物科技有限公司;胎牛血清(FBS),美国Hycolne公司;DMEM培养基、LipofectamineTM 2000试剂盒、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)和双荧光素酶活性检测试剂盒,北京索莱宝科技有限公司;LPS,美国Sigma公司;Trizol试剂,美国Invitrogen公司;miR-483-3p抑制剂(anti-miR-483-3p)、抑制剂阴性序列(anti-miR-NC)、miR-483-3p 模拟物(mimcs)、模拟对照序列(miR-NC)、APPL1过表达载体(pcDNA-APPL1)、空载体(pcDNA)、APPL1小干扰RNA(si-APPL1)、乱序无意义阴性序列(si-NC)和PCR引物,上海吉玛制药技术有限公司;逆转录试剂盒和PCR试剂盒,日本TaKaRa公司;丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒,南京建成生物工程研究所;APPL1抗体,美国Cell signaling Technology公司;B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体,美国Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染:复苏小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞,用含10% FBS的DMEM培养。将对数生长期的细胞,以1×105个/孔接种于6孔板中,采用LipofectamineTM 2000脂质体法,分别转染anti-miR-483-3p、anti-miR-NC、miR-483-3p mimcs、miR-NC、pcDNA-APPL1、pcDNA,共转染si-NC与anti-miR-483-3p、si-APPL1与anti-miR-483-3p。转染6 h后,更换培养基。再培养24 h,收集细胞备用。

1.2.2 细胞分组处理:调整小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞浓度为2.5×104个/ml,以1.0 ml/孔接种于24孔板中。未转染的细胞分为对照组(Con组)和LPS组。Con组细胞正常培养24 h,LPS组细胞用含10 μg/ml[7]LPS的培养基培养基24 h。转染anti-miR-483-3p、anti-miR-NC、pcDNA-APPL1、pcDNA、si-NC与anti-miR-483-3p、si-APPL1与anti-miR-483-3p的细胞,均用含10 μg/ml LPS的培养基培养24 h,并分别记为LPS+anti-miR-483-3p组、LPS+anti-miR-NC组、LPS+pcDNA-APPL1组、LPS+pcDNA组、LPS+anti-miR-483-3p+si-NC组、LPS+anti-miR-483-3p+si-APPL1组。培养结束后,收集细胞,进行相应指标检测。

1.2.3 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞中miR-483-3p和APPL1表达:Trizol试剂RNA,逆转录为cDNA,行PCR扩增。引物序列:miR-483-3p上游5’-CCCGGGCTTGTCTTTTGTT-3’,下游5’-GAGTGGG TGGCTCACTCTTCTG-3’;APPL1上游5’-GTGCCACAGCTGAGCTGCCCG-3’,下游5’-TGCCCAGATCCTTCGCAGCC-3’;U6上游5’-TGGCCCATGCTATATGCTCC-3’,下游5’-CGGATAGGCCCTCTTGAGA-3’;GAPDH上游5’-TATGATGATATCAAGAGGG T AGT-3’,下游5’-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3’。miR-483-3p以U6为内参,APPL1以GAPDH为内参,2-ΔΔCt法计算miR-483-3p和APPL1 mRNA的相对表达水平。

1.2.4 酶联免疫吸附法检测细胞中MDA和SOD水平:裂解细胞,3 500 r/min离心10 min,上清液-20℃冰箱保存备用。分别参照MDA和SOD试剂盒说明书,硫代巴比妥酸法检测上清中MDA含量,黄嘌呤氧化酶法检测上清中SOD水平。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞凋亡:PBS清洗细胞2次,参照Annexin V-FITC/PI试剂盒,用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.6 蛋白印迹(western blot)法检测细胞中APPL1、Bcl-2和Bax蛋白表达:RIPA试剂提取总蛋白,BCA法对蛋白定量,然后行SDS-PAGE电泳,并将分离蛋白湿转至PVDF膜。置于5 %脱脂奶粉溶液中封闭1 h,分别加入APPL1(1∶1 000)、Bcl-2(1∶8 000)、Bax(1∶8 000)和GAPDH(1∶1 500)一抗,4℃孵育过夜。加入山羊抗兔二抗(1∶5 000),室温孵育1 h。加显影液避光显影,曝光拍照。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验验证miR-483-3p与APPL1靶向关系:PCR扩增含miR-483-3p结合位点的APPL1的3’UTR序列,克隆到p-GL3.0质粒,构建APPL1野生型(WT-APPL1)双荧光光素酶报告载体。同时利用基因突技术将结合位点突变,克隆到p-GL3.0质粒,构建突变型(MUT-APPL1)双荧光光素酶报告载体。将载体分别与miR-483-3p mimic、miR-NC共转染至细胞。转染6 h后,更换培养基。再培养24 h,收集细胞,检测荧光素酶活性。

2 结果

2.1 miR-483-3p和APPL1在LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中的表达 与Con组比较,LPS组miR-483-3p水平升高(P<0.05),APPL1的mRNA和蛋白水平降低(P<0.05)。见图1,表1。

图1 LPS诱导小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞后细胞中APPL1蛋白表达

表1 miR-483-3p和APPL1在LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中的表达

2.2 干扰miR-483-3p表达对LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响 与Con组比较,LPS组MDA含量升高(P<0.05),SOD活性降低(P<0.05),细胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05)。与LPS+anti-miR-NC组比较,LPS+anti-miR-483-3p组MDA含量降低(P<0.05),SOD活性升高(P<0.05),细胞凋亡率和Bax蛋白水平降低(P<0.05),Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。见图2、3,表2。

图2 LPS诱导干扰miR-483-3p表达的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞后Bax和Bcl-2蛋白表达

图3 LPS诱导干扰miR-483-3p表达的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞后细胞凋亡流式图

表2 干扰miR-483-3p表达对LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响

2.3 APPL1过表达对LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响 与LPS+pcDNA组比较,LPS+pcDNA-APPL1组MDA含量降低(P<0.05),SOD活性升高(P<0.05),细胞凋亡率和Bax蛋白水平降低(P<0.05),Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。见表3,图4。

2.4 miR-483-3p靶向调控APPL1的表达 与共转染WT-APPL1的miR-NC组比较,共转染WT-APPL1的miR-483-3p组荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。与共转染MUT-APPL1的miR-NC组比较,共转染MUT-PPL1的miR-483-3p组荧光素酶活性变化差异无统计学意义(P>0.05)。miR-483-3p组APPL1蛋白水平低于miR-NC组(P<0.05),anti-miR-483-3p组APPL1蛋白水平高于anti-miR-NC组(P<0.05)。见图5、6,表4、5。

表3 APPL1过表达对LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响

图4 APPL1过表达对LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的影响;A LPS诱导过表达APPL1的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞后APPL1、Bax和Bcl-2蛋白表达;B LPS诱导过表达APPL1的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞后细胞凋亡流式图

图5 APPL1的3’UTR中含有与miR-483-3p互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

2.5 抑制APPL1表达逆转了干扰miR-483-3p表达对LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的作用 与LPS+anti-miR-483-3p+si-NC组比较,LPS+anti-miR-483-3p+si-APPL1组MDA含量升高(P<0.05),SOD活性降低(P<0.05),细胞凋亡率和Bax蛋白水平升高(P<0.05),APPL1和Bcl-2的蛋白水平降低(P<0.05)。见图7,表6。

图6 APPL1蛋白表达

表5 miR-483-3p调控APPL1蛋白表达

图7 抑制APPL1表达逆转了干扰miR-483-3p表达对LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡的影响;A LPS诱导的干扰miR-483-3p和APPL1表达的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞后APPL1、Bcl-2和Bax蛋白表达;B LPS诱导的干扰miR-483-3p和APPL1表达的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡流式图

表6 抑制APPL1表达逆转了干扰miR-483-3p表达对LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响

3 讨论

miRNA在真核生物体中广泛存在,研究已表明,多种miRNA参与脓毒症的发展进程。miR-19b-3p在脓毒症患者血清中表达降低,是败血症患者28 d生存的独立预后因素,过表达miR-19b-3p减轻了脓毒症诱导的炎性反应,其可能是脓毒症患者早期诊断和预后的潜在生物标志物[8];靶向下调miR-34b-5p表达可减轻脓毒症诱导的小鼠肺微血管内皮细胞炎性反应和细胞凋亡,为脓毒症诱导的急性肺损伤提供了新的分子靶点[9];miR-150-5p在LPS诱导H9c2细胞建立的脓毒症细胞中表达下调,上调其表达可减轻脓毒症细胞模型炎性反应[10]。

作为一种miRNA,miR-483-3p在肿瘤、心血管疾病等多种疾病中发挥调控作用,是疾病治疗的潜在分子靶点[11,12]。例如,miR-483-3p在急性心肌梗死(AMI)患者中表达升高,其过表达可促进心肌细胞凋亡[13]。但目前,miR-483-3p对Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的影响和机制还未知。本研究首先通过LPS诱导小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞后发现,miR-483-3p在LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中表达升高,提示其可能参与Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤。

脓毒症发生发展过程中,肺组织中大量中性粒细胞和巨噬细胞被激活,导致肺局部氧自由基增多,过量的自由基打破肺组织中氧化/抗氧化平衡,损伤肺组织[14]。MDA和SOD是氧化应激的重要指标[15]。MDA是脂质过氧化产物之一,其表达水平可间接反映氧化应激水平。SOD是机体内重要的抗氧化酶,可清除自由基,减轻自由基对细胞和组织损伤。本研究显示,LPS诱导小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞后,细胞中MDA含量升高,SOD活性降低,与相关报道结果[16]一致,表明LPS诱导小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞产生氧化应激反应。而干扰miR-483-3p表达后,LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中MDA含量降低,SOD活性升高,表明干扰miR-483-3p表达可有效降低LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞氧化应激反应,减轻细胞损伤。

氧化应激可进一步诱导细胞凋亡。Bcl-2和Bax是细胞凋亡过程中重要的调控蛋白,Bcl-2表达升高可抑制细胞凋亡,而Bax表达升高则促进细胞凋亡[17]。本研究显示,LPS处理小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞后,细胞凋亡率和Bax蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低,表明LPS可加剧小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡。而干扰miR-483-3p表达可有效抑制LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡,提示靶向干扰miR-483-3p表达可能降低脓毒症患者肺损伤,miR-483-3p可能是脓毒症治疗的潜在分子靶点。

为了进一步探讨干扰miR-483-3p表达保护LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的分子机制,本研究利用双荧光光素酶报告基因实验及Western Blot法检测miR-483-3p对小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中APPL1蛋白表达的影响,证实了miR-483-3p靶向负调控APPL1表达。研究显示,过表达APPL1可降低高糖诱导的小鼠足细胞凋亡,降低足细胞损伤,APPL1可能成为糖尿病肾病的新治疗靶点[18];APPL1可通过调控Nrf2/HO-1途径抑制绒毛膜滋养层细胞氧化应激和凋亡[19]。但是,目前还未见APPL1影响LPS诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤的相关报道。本研究显示,LPS可诱导小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中APPL1的表达,过表达APPL1可降低LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞氧化应激和凋亡,表明APPL1是Ⅱ型肺泡上皮细胞的因子。本研究还显示,抑制APPL1表达逆转了干扰miR-483-3p表达对LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞氧化应激和凋亡的抑制作用,提示干扰miR-483-3p表达通过靶向上调APPL1表达来抑制LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞氧化应激和凋亡,减轻细胞损伤。

综上所述,干扰miR-483-3p表达可抑制LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞氧化应激和凋亡,减轻细胞损伤,其可能通过靶向负调控APPL1表达发挥作用,miR-483-3p/APPL1可能为脓毒症急性肺损伤的治疗提供了潜在分子靶点。

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