结直肠癌组织中LAMβ1、ARPC4、Cx26的表达及对肿瘤侵袭、转移的影响

袁园， 戴美云， 徐浩

近年来我国结直肠癌(colorectal cancer，CRC)的术后复发及不可控的肿瘤转移是导致患者预后不良乃至死亡的关键因素，CRC的早发现、早确诊对于改善患者预后具有重要意义[1]。层粘连蛋白β1(Lamininβ1，LAMβ1)与胃癌、肝癌转移密切相关[2]。肌动蛋白相关蛋白2/3复合体4(actin-related protein 2/3 complex 4，ARPC4)为Arp2/3复合体的亚基之一，Arp2/3复合体在构成细胞骨架、维持细胞形态及运动等多种与肌蛋白有关的生理活动中发挥关键作用[3]，ARPC5的上调对多发性骨髓瘤等恶性肿瘤的增殖、侵袭及转移有促进作用[4]，但对于ARPC4的研究相对较少。间隙连接蛋白26(connexin 26，Cx26)参与构成细胞间隙连接并发挥细胞增殖、分化的调控作用，Cx26、Cx43等Cx蛋白与肿瘤恶性程度有一定的联系[5]。本研究对CRC组织中LAMβ1、ARPC4、Cx26的表达及与临床病理特征的关系进行了探究，分析这三种指标对CRC侵袭、转移的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

100例结直肠癌手术切除的肿瘤组织及相应的癌旁正常组织(距肿瘤组织5 cm外的肠黏膜组织)，均置入液氮中冷冻保存。所有标本由2位病理科医师共同诊断。100例中男59例，女41例；年龄32～84岁，平均(62.5±3.8)岁；结肠癌46例，直肠癌54例；肿瘤直径<3 cm 41例，≥3 cm 59例；分化程度：低分化43例,中35例,高22例；根据国际抗癌联盟2009年发布的第7版结直肠癌TNM分期：Ⅰ期14例,Ⅱ期24例,Ⅲ期39例,Ⅳ期23例；浸润深度：黏膜下层浸润(T1)11例,固有肌层浸润(T2)22例,侵犯无腹膜覆盖的结直肠旁组织或穿至浆膜下层(T3)48例,穿透腹膜脏(T4)19例；淋巴结转移情况：无区域淋巴结转移(N0)44例，1～3个区域淋巴结转移(N1)48例，4个及以上区域淋巴结转移19例；远处转移:有35例，无65例。本研究获得医学伦理委员会批准通过。

1.2 方法

1.2.1 仪器及试剂 实时荧光定量PCR试剂盒购自美国Promega公司，Trizol试剂盒购自美国Thermo公司，光学显微镜购自日本Olympus公司，LAMβ1、Cx26兔抗人多克隆抗体购自美国Sigma公司,ARPC4兔抗人ARPC4多克隆抗体购自英国Abcam公司，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒购自美国R&D公司，BD-BRV1凝胶电泳仪购自博弗瑞德公司，LG2080凝胶成像系统购自杭州朗基科学仪器有限公司，免疫组化SP试剂盒及DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司、免疫组化二抗试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测肿瘤组织及癌旁正常组织LAMβ1、ARPC4、Cx26的mRNA表达 从液氮中取出适量组织，放入匀浆器中充分研磨并加入1 ml的Trizol，室温静置5 min，参照Trizol试剂盒说明书提取总RNA，变性凝胶电泳检测RNA完整性和纯度，反转录为cDNA,加入相应目的基因引物(LAMβ1、ARPC4、Cx26引物均由上海生工生物工程有限公司提供)，行实时荧光定量PCR检测，参照2-△△Ct公式计算mRNA相对表达水平。

1.2.3 Western blot检测肿瘤组织及癌旁组织LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表达 取体积0.5 cm3或细胞数1×106的肿瘤组织或癌旁正常组织加入100 μl的裂解液，采用BCA试剂盒定量分析蛋白含量，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳将蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入一抗和二抗，DAB显色，凝胶成像系统显像，以GAPDH为对照。

1.2.4 免疫组化法检测肿瘤组织及癌旁正常组织LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表达 取适量组织石蜡包埋，常规切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，去除内源性过氧化物酶后于37 ℃及3%H2O2环境下孵育10 min，PBS冲洗3次，抗原修复，加入枸橼酸缓冲液中煮沸15～20 min，室温冷却，PBS冲洗，封闭10 min，加入一抗和二抗，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗，DAB染色，苏木精复染，乙醇脱水至二甲苯透明，干燥后树脂封片。PBS作为对照，染色标准判断以肿瘤细胞质和细胞膜着色为基准：统计20个高倍视野(×400)下免疫组化染色细胞，染色面积：着色范围≤10%为0分，10%<着色范围≤25%为1分，25%<着色范围≤50%为2分，50%<着色范围≤75%为3分，着色范围>75%为4分；染色强度：无色0分，弱染色1分，中染色2分，强染色3分。以两种积分之和0分为阴性，1～2分为弱阳性(+)，3～5分为阳性(++)，>5分为强阳性(+++)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 RT-PCR及Western blot检测结果比较

RT-PCR结果显示，结直肠癌组织中LAMβ1、ARPC4、Cx26的mRNA表达高于癌旁组织，(P<0.05)。Western blot检测结果显示，结肠癌组织中LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表达高于癌旁组织，(P<0.05),见表1、图1。

图1 Western blot检测结直肠癌组织及癌旁组织中LAMβ1、ARPC4、Cx26表达

表1 癌旁组织及结直肠癌组织中LAMβ1、ARPC4、Cx26 mRNA表达比较

2.2 免疫组化结果比较

免疫组化结果显示，LAMβ1、ARPC4、Cx26着色主要分布于肿瘤细胞的细胞膜和细胞质中。LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白在结直肠癌组织中表达以阳性为主，在癌旁正常组织中表达以阴性为主，结直肠癌组织中LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表达高于癌旁正常组织(P<0.05)。见表2、图2。

表2 结直肠癌组织及癌旁正常组织中LAMβ1、ARPC4、Cx26表达免疫组化检测结果比较[例(%)]

2.3 临床病理特征与LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表达的关系

不同性别、年龄、肿瘤大小结直肠癌患者LAMβ1、ARPC4、Cx26的表达差异无统计学意义(P>0.05)；不同分化程度、临床分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移结直肠癌患者LAMβ1、ARPC4、Cx26的表达差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 结直肠癌患者临床病理特征与LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表达的关系[例(%)]

注：1A为LAMβ1 在癌旁正常组织中的表达，2A为LAMβ1在结直肠癌组织中的表达；1B为ARPC4 在癌旁正常组织中的表达，2B为ARPC4在直肠癌组织中的表达；1C为Cx26 在癌旁正常组织中的表达，2C为Cx26在直肠癌组织中的表达图2 结直肠癌组织及癌旁正常组织LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白免疫组化图(×400)

2.4 LAMβ1、ARPC4、Cx26 mRNA及蛋白表达相关性分析

Pearson相关性分析结果显示，结直肠癌组织中LAMβ1与ARPC4(r=0.533)、LAMβ1与Cx26(r=0.528)、ARPC4与Cx26(r=0.510)的mRNA表达存在正相关性(均P<0.05)；LAMβ1与ARPC4(r=0.571)、LAMβ1与Cx26(r=0.497)、ARPC4与Cx26(r=0.559)蛋白表达之间同样存在正相关性(均P<0.05)。

3 讨论

结直肠癌为人类的常见肿瘤，由于各种原因的影响，多数患者确诊时已处于进展期，尽管通过手术、放化疗等综合治疗取得了一定的效果，但患者5年生存率仍不理想。其中，癌细胞转移至肝脏、淋巴结或腹腔等是治疗失败的重要原因[6]。肿瘤的侵袭、转移是一个十分复杂的过程，是有多步骤、多基因参与调控。本研究结果显示，结直肠癌组织的LAMβ1、ARPC4、Cx26 mRNA表达高于癌旁组织，LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表达也显著高于癌旁组织，免疫组化染色结果获得了同样的结果。

层粘连蛋白为细胞外基质中的非胶原糖蛋白，是细胞间质中基底膜的主要成分，其在胚胎发生、细胞分化和组织结构支持等方面起重要作用。研究表明[7]，癌细胞对于基底膜的降解、粘附和破坏是浸润及转移的重要标志，因而层粘连蛋白在介导癌细胞浸润和转移的过程中具有重要作用。LAMβ1基因位于人体第4号染色体长臂33区，LAMβ1表达失调是肿瘤发生转移的重要原因。研究证实，Arp2/3复合体能够促进结直肠癌细胞在基质中的运动，从而为肿瘤的浸润、转移提供便利[8]。ARPC4为Arp2/3复合体组成的重要亚单位，其参与了细胞骨架重构和微丝合成过程。细胞骨架主要由微丝、微管和中间纤维组成，参与细胞增殖、分化、运动等重要活动，因此ARPC4对于肿瘤细胞骨架功能及结构改变影响了肿瘤的发生及发展[9]。细胞间隙连接主要由跨膜的Cx组成，细胞间隙连接允许小分子和细胞代谢产物通过细胞膜孔道进入邻近细胞，维持细胞的代谢平衡和信息沟通，调节细胞的增殖和分化。Cx异常表达可导致细胞间隙连接障碍，导致细胞间代谢共同体功能变化，这一功能的变化与多种肿瘤增殖、分化关系密切。Cx26基因主要位于13号染色体上，在机体上皮细胞中有所表达，研究证实，Cx26表达强度与移行细胞癌恶性程度存在密切关系[10-12]。本研究经Pearson相关分析结果显示，结直肠癌组织中LAMβ1、ARPC4、Cx26 mRNA表达间存在正相关性，LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白表达之间同样存在正相关性。提示，结直肠癌的LAMβ1、ARPC4、Cx26蛋白存在高度关联性。

李合等[13]研究发现LAMβ1表达与肿瘤大小存在密切关系。ARPC4下调后肿瘤细胞迁移能力出现明显降低，降低ARPC4表达可抑制癌细胞的侵袭能力[14]。研究发现[15-16]，肝癌、乳腺癌组织中Cx26持续表达，证实Cx26能够促进肿瘤细胞的局部侵袭性。本研究结果显示，不同分化程度、临床分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移结直肠癌患者的LAMβ1、ARPC4、Cx26表达差异具有统计学意义，随着肿瘤分化程度、临床分期升高、浸润深度增加及淋巴结转移、远处转移的出现，LAMβ1、ARPC4、Cx26阳性表达均明显升高。提示，结直肠癌发生发展时，LAMβ1、ARPC4、Cx26基因及蛋白表达均转入高活性、高表达状态。因此，检测LAMβ1、ARPC4、Cx26有助于了解结直肠癌患者肿瘤发展、转移情况，可为临床诊断及治疗提供指导及新的潜在靶点。

本研究存在一定的局限性，未对LAMβ1、ARPC4、Cx26表达与结直肠癌患者长期预后的关系进行研究，对LAMβ1、ARPC4、Cx26之间的联系也未进行深入探究。