食管癌放疗相关敏感基因研究进展*

龙恩，游冬玲，徐鹏，路顺，王树斌，郎锦义

646000四川 泸州, 西南医科大学 肿瘤科(龙恩、游冬玲、郎锦义)，610041 成都, 四川省肿瘤医院·研究所，四川省癌症防治中心，电子科技大学医学院 放射治疗科(徐鹏、路顺、王树斌、郎锦义)

国际癌症研究机构2018年数据披露，全世界185个国家36种癌症中，食管癌的新发及死亡病例排名分别为第9位和第6位[1]。在中国，根据相关统计报告显示，食管癌在全部癌种中发病率位于第5，死亡率位于第4[2]。食管癌的主要病理分型有鳞状细胞癌和腺癌[3]，此外还包括小细胞癌、基底癌、移行癌以及非特异性癌[4]。

放射治疗是食管癌治疗的重要手段，对局部晚期食管癌的治疗有着重要意义。食管癌预后差，其5年总体生存率为30%～40%，尽管现在放疗技术已经取得了长足的发展，但仍然存在食管癌细胞对放疗不敏感从而导致治疗疗效降低的问题[5]。放疗抵抗相关因素众多，包括相关基因的改变、肿瘤微环境(tumor microenviroment,TME)变化、肿瘤干细胞存在等。目前科学家们尝试从基因水平找到食管癌放疗抵抗的原因，找出与食管癌放疗敏感性相关的基因，从而判断食管癌放疗的预后，并通过升高或降低这些基因的表达水平达到增强食管癌放疗敏感性、提高预后的效果。本综述将对不同分子机制作用的基因与食管癌放射敏感性关系的最新研究进展进行综合阐述。

1 细胞周期相关基因

处于细胞周期不同阶段的癌细胞对放疗的敏感性不同，一般说来，对放疗的敏感性通常在G2/M期达到峰值，而在S期后期，细胞的放射抵抗力最强。p53是人类细胞癌变中突变最广泛的基因，在至少40%的食管肿瘤中发生突变。p53抑癌基因作用于调节由DNA损伤引起的细胞周期阻滞和凋亡。p53基因根据DNA的受损伤程度，通过细胞周期阻滞和DNA修复系统的方式拯救DNA损伤小的细胞，同时促进DNA损伤不可修复的细胞凋亡。许多基因通过调节p53基因及其蛋白的表达水平来调节细胞周期。序列相似性家族135，成员B(family with sequence similarity 135,member B,FAM135B)被证实在食管鳞癌中高表达，沉默FAM135B可以抑制细胞周期蛋白(pP53等)的表达和集落形成能力，促使经过放射治疗后的细胞周期阻滞在G2/M期。最新的研究通过使用不同照射剂量照射6种食管癌细胞株发现，表达高水平FAM135B的食管癌细胞具有放射抵抗性，而沉默FAM135B可以提高食管癌细胞的放射敏感性[6]。根据孙蕊格等[7]的报道，沉默细胞黏附分子CHL1基因后，经X线照射的食管癌细胞存活率明显降低，细胞被阻滞在G2/M期百分比增加，细胞增殖能力被抑制，放射敏感时增强。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAP)家族成员Survivin基因具有细胞周期依赖性，它在G2/M期的表达显著增加，有研究使用放射治疗联合survivin抑制剂治疗食管癌，证实其可以抑制辐射诱导的survivin上调，增强食管癌细胞放射敏感性[8]。

鼠双微体基因-2(murine double minute2,MDM2)为癌基因，在人体内被称为HDM2,是抑癌基因p53的负性调控因子。MDM2在其N端有一个p53结合结构域，当野生型p53受到例如DNA损伤等刺激时被激活，MDM2在N端与p53结合，抑制p53的转录激活，通过泛素化蛋白酶体途径促进p53的降解。p53能与MDM2的P2启动子结合，增加MDM2的表达，进而增加其蛋白水平。MDM2和p53之间的相互作用形成了一个自动调节反馈回路。MDM2/p53在肿瘤抑制中发挥重要作用，高表达的MDM2可引起的癌细胞增殖、抑制细胞凋亡[9]。研究证实，在食管癌中降低该基因的表达可以增加放射敏感性[10]。针对阻断p53和MDM2之间蛋白-蛋白相互作用，已经开发了几种小分子，目前正在一些临床研究中进行验证[11]。Nutlin-3作为MDM2拮抗剂已被证实可以提高野生型p53的食管癌细胞的放射敏感性[12]。

非洲爪蟾蜍驱动样蛋白靶向蛋白2(targeting protein for Xenopus kinesin-like protein,TPX2)基因位于人类染色体20q11.1，编码一种微管相关蛋白，在纺锤体形成及有丝分裂过程中起着重要作用，通过促进染色质微管成核来调节纺锤体成型、稳定纺锤体微管[13]。TPX2在多种人类癌症中过表达，并促进癌症进展。Chen等[14]报道，降低TPX2的表达后，p53和MDM2的表达水平增加。免疫共沉淀实验显示TPX2与MDM2和p53之间存在直接的相互作用。抑制TPX2表达可以触发并激活p53通路，从而抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。已有研究证实TPX2基因的表达与食管癌细胞生长相关[15]，但该基因的表达水平与食管癌放射敏感性的关系目前还有待进一步探索。不过有报道称TPX2过表达可降低肺鳞癌的放射敏感性，抑制细胞凋亡[16]。

Wnt信号通路参与诸多生理过程，其在癌组织中被高度激活，β-catenin是经典Wnt信号通路中关键的下游调节因子。经典的Wnt信号通路分为β-catenin依赖型(典型)和β-catenin独立型(非典型)两种类型，典型Wnt信号通路主要参与调节细胞增殖[17]，通过影响肿瘤细胞的细胞周期、增殖、凋亡以及侵袭等途径参与调控细胞抗辐射性[18]。研究发现,WNT1诱导信号通路蛋白(Wnt induced secreted protein,WISP)1-3在各种人类癌症中起着不同的生物学功能，WISP蛋白在癌症细胞增殖、凋亡、侵袭和转移中发挥重要作用[19]。WISP1被证实是食管鳞癌放疗预后不良因素[20]。最新研究发现，丝氨酸蛋白酶抑制剂kazal type5(the serine protease inhibitor kazal type5,SPINK5)通过抑制Wnt/β catenin信号通路在食管癌中发挥抑癌作用，抑制食管癌细胞的增殖和迁移[21]，Ras GTPase激活蛋白SH3结构域结合蛋白1(Ras GTPase-activating protein SH3 domain-binding protein 1,G3BP1)在食管癌中的作用也与Wnt/β catenin信号通路相关。研究表明，沉默G3BP1可以抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而过表达G3BP1则会产生相反的结果[22]。相同机制的还有RAB11A(小GTPases超家族成员)、p53和DNA损伤调控基因1(p53 and DNA damage-regulated gene 1,PDRG1)[23-24]等。但这些基因和蛋白与食管癌细胞放射敏感性之间的关系还有待进一步研究。

除p53相关通路、Wnt/β catenin信号通路外，与细胞周期、增殖和凋亡相关的信号通路还有很多，经典的还包括P13K/Akt、Bcl-2/Bax、JAK-STAT等信号通路。不同通路之间存在着广泛而深刻的联系，互相交联，共同作用，调节细胞功能。

2 DNA修复相关基因

复杂的DNA修复系统是防止基因突变致癌的重要保护机制，因此，有大量的研究集中探讨了DNA修复能力与肿瘤发生、发展的关系。癌症可以通过上调DNA修复酶对放疗产生抵抗性，因此可以抑制DNA修复通路来降低这种放射抵抗性，从而提高癌细胞对放疗的敏感性。DNA修复机制主要有四种:错配修复(mismatch repair,MMR)、碱基切除修复、核苷酸切除修复、双链断裂修复。X射线修复交叉互补组1(X-ray repair cross complementing group 1,XRCC1)在碱基切除修复中发挥着重要作用，碱基切除修复可由氧化应激、DNA甲基化剂和电离辐射激活，XRCC1蛋白由XRCC1基因编码，能通过直接与聚合酶β、DNA连接酶III以及多聚(ADP-核糖)聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)作用，固定电离辐射和DNA甲基化引起的碱基损伤，表明XRCC1可能与放射治疗敏感性相关。XRCC1基因有3个常见的多态性位点，分别是Arg194Trp、Arg399Gln和Arg280His。有文献报道，XRCC1基因多态性与食管癌放射敏感性相关[25]。切除修复交叉互补(the excision repair cross-complementing,ERCC)基因家族通过对核苷酸切除和修复减少对DNA的损伤。在食管癌中，ERCC1阳性或高表达与不良的预后相关，表现出对以铂类为基础化疗的耐药性[26]。目前针对ERCC1与癌症放射敏感性的相关研究较少，已有研究通过siRNA技术沉默ECRR1基因发现提高了肺腺癌的放射敏感性[27]。在一项回顾性研究当中，通过免疫组化测定食管癌组织中表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、XRCC3和人类8-羟基鸟嘌呤糖苷酶1(human 8-hydroxyguanine glycosidase 1,HOGG1)表达水平，结果显示EGFR、XRCC3及HOGG1表达阳性的患者，其放疗疗效较阴性表达者低，由此推断EGFR、XRCC3及HOGG1可能为食管癌放射治疗的预后标志物[28]。MMR基因是一类与碱基错配修复相关的基因，与癌基因和抑癌基因对细胞的增殖分化具有直接作用不同，MMR基因能通过特异性识别及修复DNA复制过程中产生的错误，间接抑制肿瘤的发生发展。与癌症相关的MMR包括MLH1，MLH2、MLH3、MSH2，MSH3、MSH6、PMS1、PMS2、EpCAM等。通过对人类肺腺癌细胞进行低剂量照射发现，低MLH1表达的癌细胞会表现出对放疗的敏感性[29]。DNA双链断裂是最有害的DNA损伤形式，会导致细胞死亡和活的染色体重排，此时DNA损伤传感器作为DNA损伤反应蛋白能检测DNA损伤，已被证实的DNA损伤传感器蛋白包括γH2AX, 53BP1, Nbs1, BRCA1/2和Ku。其中γH2AX作为一个典型的标志物已从实验研究转为临床应用[30]。γH2AX(histone H2AX)是磷酸化的组蛋白H2AX，在DNA双链断裂修复过程中起着关键作用，是一种对DNA双链断裂的快速细胞反应，在DNA修复过程中累积形成γH2AX foci。CD59缺陷的食管癌细胞在经过射线照射后γH2AX foci消失，损害了DNA修复过程，致使细胞增殖受到阻碍，使细胞周期阻滞在G2/M期，最终导致细胞衰老死亡。因此，缺乏CD59可使食管癌细胞对放疗敏感[31]。高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)是一种保守且普遍的非组蛋白染色体蛋白，作用于DNA修复过程。HMGB1参与了辐射诱导的H2AX的磷酸化，敲除HMGB1则会抑制H2AX磷酸化，阻碍DNA修复，同时使得细胞周期阻滞在G0/G1期，增加细胞凋亡。因此，敲除HMGB1能增强食管癌细胞放射敏感性[32]。性别决定区Y的盒内基因17(SRY-box containing gene 17,SOX17)负调控Wnt/catenin信号通路的转录活性。Sox基因编码转录因子属于HMG超家族的一员，与人类癌症的发生存在着许多联系。研究发现SOX17在肝细胞癌、结直肠癌、肺癌等癌症中低表达，并与其不良预后相关。Kuo等[33]研究了食管鳞癌患者中SOX17的表达水平以及基因的甲基化与同步放化疗反应之间的联系，发现在70例接受同步放化疗的食管鳞癌患者中，SOX17低表达与DNA高甲基化和同步放化疗的不敏感性显著相关。而SOX17的稳定过表达则可使食管癌细胞对顺铂、放疗及同步放化疗敏感。

3 上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和癌症干细胞(cancer stem cell,CSC)相关基因

EMT是上皮细胞向间质细胞转化的过程。在EMT过程中，上皮细胞获得迁移特性，失去上皮标记物，比如E-cadherin粘附蛋白，并表达间质标记物，比如波形蛋白和N-cadherin。EMT过程分为3类：I类EMT参与着床、胚胎发生和器官发育；II类EMT促进组织再生和器官纤维化；III类EMT则参与癌细胞转移和耐药。EMT过程由复杂的信号通路网构成，包括转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β),Wnt,Notch,EGFR,磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt),NF-κB和细胞外信号调节激酶[34]。在食管癌放射敏感性相关的研究中，低表达的序列相似性83的家族，成员D(family with sequence similarity 83,member D,FAM83D)通过Akt/GSK-3β/Snail信号通路诱导EMT，增强食管鳞癌的放射感性[35]。FH535(Wnt/β-catenin通路抑制剂)可通过抑制Wnt/β-catenin通路降低食管癌细胞EMT，从而增强其放射敏感性[36]。就EMT过程的其他通路而言，EGFR/ErbB1是一种酪氨酸激酶受体，属于ErbB家族，EGFR及其下游通路在EMT调节中发挥着重要作用。EGFR的表达水平与癌细胞放化疗敏感性相关，EGFR表达水平增高可以增强癌细胞对放化疗的耐药或抵抗性。MicroRNA-200c(miR-200c)被发现在一些癌症中能通过抑制EMT过程从而抑制肿瘤，异位过表达miR-200c能增强伴随EGFR信号激活的人类癌细胞的放射敏感性[37]。DLX2基因(一种同源框转录因子)被发现通过激活smad2/3依赖的TGF-β通路参与EMT过程。在肺癌细胞中，降低DLX2基因的表达可以提高其放射敏感性[38]。Notch通路包括4个Notch旁系同源基因(Notch1-4)和Notch配体(dll1/4/4和Jagged1/2)，其中Notch1和3在宫颈癌中高表达。FTS基因最初在被敲除6个基因的小鼠突变体中识别，其作用是导致小鼠脚趾融合。通过敲除宫颈癌中FTS基因表达发现，FTS低表达能降低电离辐射引导的Notch1、裂解Notch1、Notch3、γ-分泌酶复合物及其下游的hes-1蛋白表达，提高宫颈癌放射敏感性[39]。在肺腺癌和鼻咽癌中，Rab25(一种受体循环蛋白)与EGFR相互作用，细胞表面的EGFR含量对EGFR下游信号的激活具有重要的功能，而Rab25过表达的细胞中EGFR表面水平能快速恢复，Rab25的下调则导致EMT样标记物的逆转和抗细胞凋亡能力的降低[40]。核转录因子NF-κB也参与调节EMT相关的放射敏感性。A20也被称为肿瘤坏死因子α诱导蛋白3(tumor necrosis factor α induced protein 3,TNFAIP3)，是NF-κB通路的主要负调控因子，在肝癌非肿瘤组织中的表达高于肝癌组织，A20可以降低EMT过程的蛋白表达，增强电离辐射对肝癌细胞的损伤作用，提高肝癌的放射敏感性[41]。目前，关于EMT过程基因突变与食管癌放射敏感性的关系还在进一步探索中。

肿瘤干细胞不同于一般肿瘤细胞，它代表了一个具有特定表面标记物和包括自我更新、肿瘤发生和进展在内的功能特性的亚群。肿瘤内部存在CSC是产生放射耐受的主要机制，是肿瘤转移复发以及放疗失败的重要原因。CSC在肿瘤细胞中的比例与其预后密切相关，而CSC的抗辐射能力可以是原发性的，也可以是获得性的，CSC的这种可塑性高度依赖于EMT过程[42]。蛋白酪氨酸激酶7(protein tyrosine kinase 7，PTK7)又称结肠癌激酶4(colon cancer kinase 4，CCK-4)(因其在结肠癌组织中具有高表达)，是受体蛋白酪氨酸激酶RTK家族成员，参与多种生物学功能，与肿瘤发生发展过程相关。Bie等[43]报道PTK7激活P53通路调控的CSC恶性行为，促进食管鳞癌发生。另外，PTK7高表达的食管鳞癌细胞比低表达者具有放疗抗性[44]。细胞因子信号抑制因子(suppressor of cytokine signaling,SOCS)家族由SOCS1-7和CIS在内8个蛋白组成，用于负性调控细胞因子受体信号。最新的研究发现，SOCS6蛋白表达可以降低食管鳞癌的细胞干性，进而增强食管鳞癌的放射敏感性[45]。端粒酶在CSC中高度表达，是CSC实现永生化的关键。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)是调控端粒酶活性的重要催化亚基，在维持CSC表型方面起着重要作用。Chen等[46]的研究通过下调鼻咽癌细胞中hTERT表达发现，hTERT表达水平的降低增强了鼻咽癌细胞的放射敏感性。

放射敏感性相关基因及其分子机制详见表1。

表1 放射敏感性相关基因及其分子机制

4 微小RNA(micro RNA，miRNA)

miRNAs是非编码的，有22个核苷酸的单链RNA，是在动植物中都被发现的一类新的基因调节因子。miRNA在干细胞维持和在发育过程中指导某些细胞类型分化，在肿瘤的发生和进展过程中扮演着十分重要的角色，超过50%的人类miRNA基因经常位于与癌症相关的脆弱位点和基因组区域。miRNA指导组织特异性发育，有人比较了肿瘤样本和正常组织的miRNA表达谱，发现217个miRNA中有129个在肿瘤中表达水平较低，而与组织来源无关，与正常组织相比，肿瘤中miRNAs的表达谱可能反映了这些细胞的分化程度，暗示了miRNA表达异常可能直接导致细胞去分化，从而导致肿瘤形成[47]。miRNA与肿瘤形成关系密切，其与肿瘤细胞放射敏感性之间的关系也有大量文献报道。miRNA对肿瘤放射敏感的具体调控机制包括细胞周期调控、细胞凋亡、DNA损伤修复、TME等。miRNA200家族被证实与多种恶性肿瘤密切相关，包括miRNA-200a,miRNA-200b,miRNA-200c和miRNA-141。其中miRNA-200c被普遍认为与肿瘤放化疗治疗敏感性相关。Zheng等[48]的研究发现，miRNA-200c通过调节蛋白Cyclin B1、cdc2和P21的表达使细胞周期阻滞在G2/M和G1下期从而增加放射敏感性。miR-301a在多种癌症中异常表达，是一种重要的miRNA，位于染色体17q22-17q23。研究表明，miR-301a可以通过下调N-myc下游调控基因2(N-myc downstream-regulated gene 2，NDRG2)增强前列腺癌细胞的放疗抵抗。在食管癌中，Su等[49]研究发现，miR-301a可通过靶向WNT1，抑制食管癌细胞的增殖和迁移，进而增强其放射敏感性。另外，miR-153-3p表达上调可促进胶质瘤细胞凋亡，提高caspase-3活性，增强该肿瘤细胞的放射敏感性[50]。miR-146a-5p通过与复制蛋白A3(replication protein A3,RPA3)结合，激活DNA损伤修复通路，增强肝细胞癌放射敏感性[51]。最近的研究报道了RAD21基因、MiRNA-320b与肝细胞癌放射敏感性之间的关系，RAD21作为一种DNA修复基因，被认为与肿瘤形成有关，在调节细胞生长和保护细胞免受DNA损伤方面发挥作用，miRNA3320b可靶向RAD21 3’UTR抑制RAD21的表达，增强肝细胞癌放射敏感性[52]。miRNA参与了从癌变开始到转移扩散的全部阶段，并可通过多种作用机制调节食管癌的放射敏感性，加上miRNA可以从人类组织体液中被快速检测，其有望成为新的食管癌预测标志物和潜在的治疗靶点。

5 长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)

lncRNA是指长度超过200个核苷酸的非编码RNA，存在于广泛的物种中，并且作为调节因子几乎参与所有细胞过程，其主要在转录及转录后水平调控基因表达，参与细胞分化、细胞周期等[53]。随着RNA测序技术的不断发展，lncRNA已然成为肿瘤研究的热点。lncRNA被证实在多种癌症组织中异常表达，部分研究报道了其与放射敏感性之间的关系。lncRNA可通过多种机制影响癌细胞放射敏感性，包括DNA损伤修复、细胞周期阻滞、凋亡、癌症干细胞调控、EMT和自噬[54]。Li等[55]发现长链非编码RNA核糖核酸酶P RNA组分H1(the long non coding RNA ribonuclease P RNA component H1lncRNA,Rpph1)在食管癌患者的癌组织与血清中高表达，且血清Rpph1高表达的患者3年总生存率明显低于血清Rpph1低表达的患者。通过照射食管癌细胞株TE-1和Kyse150发现，沉默Rpph1的细胞株存活率均随着照射剂量增加而下降，表明沉默Rpph1表达可以显著增强细胞对放疗的敏感性，其机制是通过促进细胞凋亡。长链非编码RNA结肠癌相关转录因子2(the long non coding RNA colon cancer associated transcript 2,CCAT2)因首次在结肠癌中被发现而得名，也被证实在多种癌组织中异常表达[56]，体外实验表明，X线能提高食管癌细胞中CCAT2的表达，而敲除CCAT2则能促进X线诱导食管癌细胞凋亡，证实了CCAT2能增加食管癌细胞的放射抵抗性，也是通过促进细胞凋亡实现[57]。其他癌种当中，lncRNAlinc00312通过损害DNA损伤修复机制抑制鼻咽癌细胞的放射抵抗性[58]，下调lncRNASNHG12可以促进放疗诱导的宫颈癌细胞凋亡从而提高放射敏感性[59]。另外，lncRNA与miRNA在调节癌细胞放射敏感性方面关系密切[60-62]。lncRNA与miRNA是公认的癌症生物标志物，被视作潜在的肿瘤治疗靶点。将mi/lncRNA从实验研究阶段转向临床应用还有很长的路要走。

非编码RNA还包括环状RNA(circular RNA, circRNA)，是一种新型的内源性RNA，具有封闭的环状结构，对核酸外切酶不敏感，结构稳定。circRNA的主要作用机制包括通过竞争miRNA结合位点来竞争内源性RNA以及调节miRNA、调控亲本基因表达,与基因转录翻译和蛋白修饰相关。CircRNA在食管癌中作用的研究目前还处于初始阶段，其与食管癌放射敏感性之间的关系尚待研究证实[63-65]。

6 小 结

放疗是食管癌治疗的重要手段之一。从目前的基础研究和临床研究中，我们对于食管癌细胞存在的放射抵抗性的生物学机制有了一定的了解，精确的生物标记物能够帮助预测食管癌患者对治疗的反应，帮助医生找到合适的治疗方法，提高患者的总生存率。目前临床上尚无能准确预测食管癌放射敏感性的生物标志物，一些研究也仅针对实体肿瘤而非特定癌种进行，表明该基因或蛋白与癌细胞放射敏感相关性研究还处在初始阶段，相信随着研究的不断进行、高通量测序以及基因技术的发展成熟，食管癌放疗疗效可以通过确定的基因及其表达蛋白的检测被预测，从而实现指导治疗方案选择。另外，关于放射增敏剂的转化研究也具有相当的前景。总之，精准治疗是大势，对于寻找精准的食管癌放射敏感性标志物还有很长的路要走。

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