重组猪表皮生长因子对早期断奶仔猪生长性能和肠道发育的影响

徐文俊，王亚男，李凤华，周 炜，许高涛，赵 俊,4*

（1. 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司，安徽芜湖 241000；2.安徽九川生物科技有限公司，安徽芜湖 241000；3.山东迅达康兽药有限公司，山东济南 250000；4.安徽医科大学基础医学院，安徽合肥 230000）

仔猪早期断奶是养殖过程中的关键环节，可最大程度发挥母猪的繁殖性能，减少疾病在母子间的传播，提高养猪经济效益。哺乳和断奶阶段是仔猪出生后肠道生长发育的关键阶段，饮食及环境的改变容易引发断奶应激反应，导致仔猪出现生长障碍、肠道疾病、腹泻、消化和吸收不良。

在断奶期间和断奶后，仔猪从母乳中摄取表皮生长因子（EGF）的量急剧下降，该阶段母乳中含量约为124 μg/L，EGF 摄入量下降可能是消化吸收功能和黏膜防御功能降低的重要原因。EGF 作为有丝分裂原，能够促进肠道上皮组织细胞增殖与分化，通过口服方式补充外源性EGF 可调节肠上皮细胞分化，促进肠道绒毛和隐窝发育，提高肠道乳糖酶、蔗糖和碱性磷酸酶活性，同时促进肠道免疫球蛋白表达和淋巴细胞增殖，刺激肠道杯状细胞增殖和黏蛋白2（MUC2）分泌，提高断奶仔猪的免疫功能。本实验室前期试验成功利用大肠杆菌表达系统建立了重组猪表皮生长因子（Rеcombinant Porcinе Epidеrmal Growth Factor，pEGF）表达菌株。本试验旨在研究重组pEGF 的生物活性及对早期断奶仔猪生长性能和肠道发育的影响，确定其在仔猪饲料中适宜添加剂量，并为pEGF 进一步研究应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 重组pEGF 细胞学验证

1.1.1 主要试剂 重组pEGF 预混剂（有效含量为2.0 mg/g，芜湖英特菲尔生物制品产业研究院），胎牛血清、胰蛋白酶、青链双抗（Gibco 公司），DMEM/F12 培养基（GE公司），十二烷基磺酸钠（SDS）、丙烯酰胺（Sigma公司），rhEGF 国家标准品为中药标准对照品研究中心产品。

1.1.2 蛋白纯度检测 ①制样：取100 mg pEGF 预混剂溶解后与20 μL 5×上样液混匀。②蛋白胶的制备：首先把玻璃板和胶条安装好，配制分离胶，待分离胶凝固后，用滤纸吸干残留的液体，然后配制浓缩胶，灌注入玻璃板内，并将梳子垂直插入胶内，置于37℃静置30 min。③点样和电泳：待胶凝固，玻璃板拆除胶条，外槽加入一定量的电泳液，内槽加满电泳液，将处理好的样品、蛋白Markеr 依次加入胶孔，多余孔加入等体积上样液，将电泳槽的盖子盖上，连接电极。④染色和脱色：将分离胶部分置于考马斯亮蓝中，摇床振荡6 h 或过夜，然后回收染色液，将胶置于脱色液中，于摇床上脱色，直至背景很浅为止。⑤参考《中国药典》，利用软件对胶图进行扫描，测定蛋白纯度。

1.1.3 蛋白活性检测 ①BALB/C 3T3细胞株用完全培养液于37℃、5% 二氧化碳培养，控制细胞浓度为1.0×10～5.0×10个/mL，传代后24～36 h 用于生物学活性测定；②弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞，用完全培养液配成5.0×10～8.0×10个/mL 的细胞悬液，接种于96 孔板中，接种过程中不停摇匀，保持每孔接种数相同，每孔100 μL，于37℃、5% 二氧化碳条件下培养；③24 h 后换成维持培养液，置37℃、5% 二氧化碳培养24 h；④制备的细胞培养板弃去维持液，加入标准品溶液和供试品溶液，每孔100 μL，置37℃、5% 二氧化碳培养64～72 h；⑤MTT 比色法：每孔加入MTT 溶液20 μL，于37℃、5%二氧化碳培养5 h，以上操作在无菌条件下进行。弃去培养板中的液体后，向每孔中加入DMSO 100 μL，混匀后在酶标仪上，以630 nm 为参比波长，570 nm 为试验波长，测定吸光度并记录测定结果；⑥参考中国药典《重组人表皮生长因子生物学活性测定法》，试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理，并按公式计算结果：

试供品生物学活性（IU/mL）=Pr×Ds×Es/Dr×Er式中，Pr 为标准品生物学活性（IU/mL），Ds 为试供品预稀释倍数，Es 为试供品相当于标准品半效数的稀释倍数，Dr 为标准品预稀释倍数，Er 为标准品半效量的稀释倍数。

1.2 动物试验

1.2.1 试验动物与分组 选取（24±2）日龄断奶杜×长×大三元杂交健康仔猪180 头，公母各半，按照体重接近、性别比例相同的原则随机分为3 组，每组6 个重复，每个重复10 头，各组初始体重平均初始体重（7.39±0.18）kg。对照组饲喂基础日粮，试验组分别在基础日粮中添加1 mg/kg pEGF 和2 mg/kg pEGF进行饲喂，试验期为14 d。试验日粮选用扬翔乳猪教槽配合饲料，消化能≥14.64 MJ/kg，粗蛋白质≥19%，粗纤维≤5%，粗灰分≤7%，钙0.4%～1.2%，总磷0.4%～1.2%，赖氨酸≥1.3%。

1.2.2 饲养管理 试验在安徽华杰农牧科技有限公司养殖场进行试验。试验猪按栏饲养，试验期间自由采食及饮水。每天08:00、13:00、18:00 投喂饲料（根据猪场饲喂情况确定），第2 天投喂前收集剩余饲料，猪舍温度控制在25～28℃，相对湿度为50%～70%，猪舍保持环境通风。

1.2.3 测定指标 准确记录各组每天的喂料量和余料量，计算仔猪的平均日采食量（ADFI）。各组仔猪分别于试验期前后空腹称重，计算仔猪的平均日增重（ADG）。根据ADFI 和ADG 的比值来计算耗料增重比（F/G）。每天记录仔猪的腹泻头数，计算腹泻率。

在试验第15 天每组随机选取3 头仔猪注射50 mg/kg BW 的戊巴比妥钠，待完全麻醉后屠宰，屠宰后迅速从胸骨到耻骨切线打开腹腔，取出胃肠道于空肠、回肠处分别采集约5 cm 肠段，用4℃预冷1×PBS 轻轻漂洗，然后投入预先配好的10% 福尔马林固定液中，固定完成后进行脱水透明、浸蜡包埋、制片和HE 染色的步骤，利用利用尼康E-CLIPSE80i 型高级研究用正置生物数码摄影显微镜观察切片，测定绒毛长度和隐窝深度。

1.3 统计分析 试验数据用Exеcl 2016 进行初步处理，用SPSS 18.0 软件进行检验，分析差异显著性，以<0.05 作为差异显著性判断标准，以<0.01 作为差异极显著性判断标准，试验数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 重组pEGF 蛋白的纯度 由图1 可以看出，重组pEGF 预混剂中pEGF 分子量大小为27 ku，无其他明显杂蛋白，蛋白未出现明显降解，利用Tanon gis 软件对电泳图进行扫描，结果发现蛋白纯度大于90%，与预期符合一致。

图1 重组pEGF 蛋白SDS-PAGE 电泳图

2.2 重组pEGF 的生物活性 由图2 可以看出，与对照组相比，重组pEGF 促进细胞增殖功效与rhEGF 国家标准品效果相似；以rhEGF 国家标准品作为活性对照，矫正后重组pEGF 蛋白比活性为5.60×10IU/mg，表明重组pEGF 具有良好的生物活性。

图2 重组pEGF 对细胞增殖的影响（100×）

2.3 重组pEGF 对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响 由表1 可以看出，与对照组相比， 2 mg/kg 重组pEGF 组断奶仔猪ADG 提高9.82%（<0.05），而添加1 mg/kg重组pEGF 则无显著性影响；与对照组相比，2 mg/kg和1mg/kg 重组pEGF 组F/G 分别降低了0.11 和0.09（<0.05）；而不同剂量的重组pEGF 组间ADG、F/G 差异不显著；与对照组相比，1 mg/kg 和2 mg/kg 重组pEGF 组断奶仔猪的腹泻率分别降低了32.02% 和51.51%。

表1 重组pEGF 对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响

2.4 重组pEGF 对断奶仔猪肠道生长发育的影响 由图3 和表2 可以看出，与对照组相比，添加2 mg/kg 重组pEGF 能够提高仔猪空肠的绒毛高度、绒腺比（<0.05），但对仔猪空肠隐窝深度无显著性影响，添加1 mg/kg 重组pEGF 对仔猪空肠和回肠绒毛高度、隐窝深度和绒腺比均无显著性影响。

表2 重组pEGF 对断奶仔猪肠道发育的影响

图3 仔猪空肠和回肠组织病理学观察（HE 染色，200×）

3 讨 论

抗生素的应用在仔猪早期断奶应激上发挥了重要作用，但其会导致微生物产生耐药性。EGF 等乳源性生长因子能够促进肠道细胞发育，并且EGF 具有耐热、耐酸、抵抗蛋白酶消化和肠上皮细胞上广泛存在EGF 受体等特性，这些特性使得EGF 有潜力作为新一代的促生长饲料添加剂。

本试验结果表明，重组pEGF 生物活性可达到5.60×10IU/mg，纯度可到90%以上，利用基因工程可以获得高活性高纯度的重组pEGF 蛋白。在饲料中添加重组EGF 能够促进机体肠道发育，增强免疫功能，提高生产性能。有研究发现，在断奶仔猪日粮中添加重组EGF 能够显著改善仔猪生长性能，缓解腹泻，显著降低仔猪的增重成本，同时提高空肠黏膜IgA 水平和隐窝深度，调节回肠微生态菌群结构。也有研究表明，在肉鸡饲料中添加重组EGF 能够提高免疫球蛋白分泌，促进肠道生长发育。本试验结果也显示，在饲料中添加重组pEGF 能够提高断奶仔猪生长性能，缓解仔猪腹泻，促进肠道生长发育。重组pEGF 发挥功效可能与幼龄动物的胃酸和胃蛋白酶的分泌能力弱，对蛋白水解不完全有关。有研究发现，大约有70%的EGF 能够通过幼龄动物的胃，以完整蛋白形式到达小肠中部，发挥其促进细胞增殖的功效。

本研究结果发现，重组pEGF 对断奶仔猪生长性能影响存在剂量依耐性，在断奶仔猪日粮中添加2 mg/kg重组pEGF 对断奶仔猪促生长和缓解腹泻的效果优于1 mg/kg，这可能与重组pEGF 在肠道发挥作用的浓度相关。Chеung 等研究发现，EGF 需抵抗胃肠道的消化作用，并在肠道累计到一定浓度才能与肠道受体结合，从而发挥刺激细胞生长和分化的作用，而在断奶仔猪日粮中添加高剂量的重组pEGF 能够使仔猪小肠肠段与高浓度的EGF 接触，从而发挥EGF 刺激肠上皮细胞增殖分化的功效。本试验结果也发现，与对照组相比，2 mg/kg pEGF 能够有效促进空肠肠段生长发育，提高绒毛高度，降低绒腺比，1 mg/kg pEGF 则无显著性影响，而高、低剂量的pEGF 均没有显著促进回肠段肠道发育，可能与EGF 在肠道前中段逐渐被降解，在小肠后端未能达到发挥功效的浓度有关。

4 结 论

本研究结果表明，重组pEGF 是一种具有高生物活性的重组蛋白，在断奶仔猪饲粮中添加2 mg/kg 重组pEGF 可提高空肠绒毛高度，提高仔猪在断奶后14 d 内的ADG 和饲料转化效率，缓解断奶应激造成的仔猪腹泻。