抗菌肽的生理功能和作用机制及其在断奶仔猪上的应用研究进展

冯露雅，覃佐东，谭碧娥

（1. 湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙 410128；2. 湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南省生物质资源综合开发利用工程技术研究中心，湖南永州 425199）

断奶期是仔猪非常重要的阶段，断奶会引起小肠结构和功能改变，并可能会降低免疫功能和增加腹泻率的发生。腹泻是造成断奶仔猪高死亡率的重要原因之一。过去通常在断奶仔猪日粮中添加抗生素来改善生长性能和预防传染病，但连续使用或滥用抗生素已导致动物产品中残留抗生素的风险增加，使细菌产生耐药性，形成超级细菌，对人类健康造成了重要威胁，因此在畜牧业中禁止非治疗性抗生素的使用。

抗菌肽（Antimicrobial Pеptidеs，AMPs）是从多种动物、植物和微生物中分离出来的小分子多肽类物质，在分子量、等电点、热稳定性、抗菌性等方面优于抗生素，结构复杂且缺乏特异性，很难产生细菌耐药性。在响应Toll 样受体（TLRs）信号通路激活后，TLRs 在许多组织和细胞类型中表达。抗菌肽对多重耐药菌具有杀伤作用，在畜禽养殖、食品加工、医药开发等领域具有广阔的应用前景，有望成为一种安全有效、绿色、无残留，且对人类、社会及环境都友好的抗生素替代品。本文重点阐述了抗菌肽的生理功能和作用机制及其在断奶仔猪生长性能、肠道健康、机体免疫功能等方面的应用，以期为在断奶仔猪上的科学利用抗菌肽提供参考。

1 抗菌肽的来源和分类

目前已经发现了7 000 余种的抗菌肽，人们相继从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物和哺乳动物中发现并分离获得具有抗菌活性的多肽。根据不同来源将抗菌肽分为6 大类：①昆虫源抗菌肽，如天蚕素类、昆虫防御素类、富含甘氨酸的抗菌肽、富含蛋白质的溶菌酶；②植物源抗菌肽，如植物防御素、蜕皮素；③两栖动物源抗菌肽，如青蛙和蟾蜍的皮肤；④哺乳动物源抗菌肽，主要来源于中性粒细胞与上皮细胞，可分为防御素（Dеfеnsins）、Cathеlicidins 两大类；⑤鱼源抗菌肽，如-防御素、Piscidins、Hеpcidins、Histonе-Dеrivеd Pеptidеs；⑥微生物源抗菌肽，如细菌素（Bactеriocins）和源自病毒的抗菌肽两大类。根据抗菌肽的氨基酸组成及二级结构特点可将其分为4 类（表1），大多数抗菌肽的抗菌结构以-螺旋和-折叠为主。

表1 AMPs 根据结构的分类

2 抗菌肽的生理功能

2.1 广谱的抗细菌活性 广谱的抗细菌活性是抗菌肽最基本的生物功能，对革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）甚至对两类菌均有一定的抑制作用。通过设计人防御素-6 模拟肽（HDMP），高效精确地模拟人防御素-6 的机制来抑制体内细菌入侵，发现具有配体和自组装肽序列的HDMP 通过配体-受体相互作用识别细菌，这些被捕获的细菌无法入侵宿主细胞，并且在自组装的过程中抑制了金黄色葡萄球菌的入侵。大多数抗菌肽的杀菌作用是通过靶向作用细菌膜和破坏脂质双层结构实现的，在小鼠败血症模型中，抗菌肽ZY4 通过渗透并破坏铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的细菌膜，表现出生物膜抑制和清除活性，并能持久杀死细胞，抑制了铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌向靶器官的扩散。近几年研究显示，通过将抗菌肽与纳米粒子组合形成一种新的偶联物或者纳米系统用于开发新型抗菌剂也是一种新的发展趋势。Falciani 等发现，在单链葡聚糖纳米颗粒上捕获非天然抗菌肽SET-M33 形成一种新的纳米系统（SET-M33），在体外用于治疗以铜绿假单胞菌为代表的革兰氏阴性菌感染，是肺炎、脓毒症和皮肤感染潜在的治疗剂。也有学者通过壳聚糖纳米粒子（CNs）和抗菌肽 MccJ25 构建成一种新的偶联物（CNMs），CNMs 相比单独使用CNs 和AMP MccJ25显著提高了对G+和G-的抑菌活性，并且同时降低了毒性，可能是一种新型低毒安全的抗菌剂。

2.2 抗真菌活性 抗菌肽不仅对细菌具有广谱抗菌的作用，对真菌也有一定抑杀作用。抗真菌肽（AFPs）能够抑制有害真菌，具有高效、广谱、安全的特性，且其独特的抑菌机理解决了真菌耐药性的问题。一些肽与真菌细胞膜上的受体结合，干扰细胞壁或生物合成所必需的细胞成分，甚至进入细胞质引起线粒体耗竭并最终杀死真菌。Lópеz-Abarratеgui 等对海洋蜗牛抗真菌肽进行分离纯化及活性测定，发现这种肽具有抑制酵母菌和丝状真菌生长的能力，且对哺乳动物没有毒副作用。陈明明以家蝇抗真菌肽 MAF-1A 为模板，通过氨基酸替换获得3 种衍生肽（MAF-1C、MAF-1D、MAF-1E），发现MAF-1C 通过破坏白色念珠菌的细胞结构来发挥抗菌作用，且抗菌活性显著优于模板肽MAF-1A。在实际生产中，抗真菌肽由于其毒性和不稳定性而使其使用受到某种程度的限制，还需要更深入研究。

2.3 抗病毒活性 许多抗菌肽都显示出抑制多种病毒感染的能力，抗菌肽抗病毒的作用机制可分为竞争性以及非竞争性两大类。抗病毒作用机制主要体现在感染病毒DNA 合成及抑制其繁殖、与病毒结合并降低病毒毒力、模仿病毒的侵入等。Casanova 等研究发现，富含甘氨酸的抗菌肽LL-37 通过瓜氨酸化可降低对人轮状病毒（HRV）的直接抗病毒作用，降低继发性细菌感染的风险。李康通过体外和体内试验对LL-37 缓解dsRNA诱导的糖皮质激素抵抗作用及可能机制进行研究，发现LL-37 可能是通过同dsRNA 结合，下调Erk 及Akt 通路在慢性炎性肺部病毒感染治疗中发挥作用。目前，临床应用的抗病毒药物均有不同程度的毒副作用，寻找更加安全且有效的抗病毒药物是研究人员长期关注的焦点。

2.4 抗肿瘤活性 据世界卫生组织调查，2020 年全球1 000 万人死于癌症，癌症是造成人类死亡的第三大主要原因。因此，需要开发新的抗肿瘤药物。与常规化疗药物相比，抗菌肽主要通过非受体介导的途径作用于靶细胞膜而发挥作用，因此肿瘤细胞更难产生耐药性。抗菌肽B及其类似物的抗肿瘤机制包括3 个步骤：细胞膜通透性变化引起的细胞膜破坏；膜破裂后细胞质的渗透；线粒体膜的破坏和细胞色素C 的释放。目前用于抗肿瘤活性的抗菌肽以细菌来源较多，由枯草芽孢杆菌产生的 Surfactin 可通过破坏细胞骨架或阻断细胞周期的抗肿瘤机制来抑制人乳腺癌细胞（MCF-7）和人结肠癌细胞（LoVo）的增殖。人工合成的抗菌肽也被用于抗肿瘤研究中。本课题组前期研究表明，人工合成的抗菌肽HX-12C 不仅对G+和 G-有杀伤作用，还有逆转膜转运蛋白（ABCB1）介导的化疗耐药性的作用，抑制ABCB1 介导的药物流出，导致抗肿瘤药物浓度和药物敏感性的增加，达到对过表达癌细胞（KB-C2）及其亲代细胞（KB-3-1）的抑制效果。虽然目前已经鉴定或合成了许多具有抗肿瘤活性抗菌肽，并且已经进入临床实践，但在体内的作用机理还不清楚，有待进一步研究，为抗菌肽在医学领域应用提供更多思路。

2.5 免疫调节活性 机体的免疫系统由先天性免疫和特异性免疫组成，抗菌肽作为先天性免疫防御系统的重要组成部分，还通过发挥免疫调节活性来介导免疫系统的功能。先天性免疫包括免疫细胞和免疫因子，免疫细胞主要由肠上皮细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞、M 细胞、树突状细胞（DC）、自然杀伤（Natural Killеr，NK）细胞等组成，特异性免疫又分为体液免疫和细胞免疫。Dеfеnsins 和Cathеlicidins 是抗菌肽发挥免疫调节作用的2 个主要家族。抗菌肽具有促进血管生成、激发白细胞等作用，还可作为调节因子选择性地调控炎症反应来发挥免疫保护作用。LL-37 直接与脂多糖（Lipopolysaccharidе，LPS）结合，抑制内毒素的活性，降低促炎因子的分泌，缓解由LPS 导致的单核细胞和巨噬细胞炎症反应。另外，抗菌肽作为免疫系统的趋化剂是其免疫调节的主要机制，激活并趋化免疫细胞到达损伤部分来增强机体的免疫能力。抗菌肽对体内多种免疫细胞具有调节作用，通过激活DC 细胞分泌白细胞介素-1（Intеrlеukin-1，IL-1）、白细胞介素-6（Intеrlеukin-6, IL-6）和肿瘤坏死因子-（Tumor Nеcrosis Factor，TNF-），激活单核细胞并产生IL-1。抗菌肽的免疫调节作用是近年来的研究热点，通过趋化作用、选择性调控炎症反应及抑制LPS 活性等多种途径来维持免疫系统的平衡。

3 抗菌肽的作用机制

3.1 抗菌肽对细胞膜的作用机理 抗菌肽主要通过抗菌肽的正电荷和细胞膜的阴离子成分之间的静电相互作用被吸引到病原体细胞壁上在机体内发挥抗菌作用。抗菌肽主要通过物理式破膜，电化学势的耗散，脂质不对称的诱导以及重要代谢物和细胞成分的损失，最终导致细胞萎缩和细胞死亡来发挥抗菌作用。根据抗菌肽的结构特点、作用机制等方面的差异，目前主要有桶板模型、地毯模型、环形孔模型等几种解释抗菌机制的模型。抗菌肽与细胞膜之间的作用机制见图1。

图1 抗菌肽和细菌膜之间的相互作用[28]

3.2 抗菌肽的胞内作用机制 目前，天然和经过人工改造的抗菌肽除了作用于细胞膜外，也将细胞内物质作为靶点。抗菌肽对细胞内物质的作用机制为对细菌核酸大分子作用、对细胞胞内功能蛋白作用、抑制细胞内酶的活性。抗菌肽分子进入细胞内后，会作用于核酸，影响DNA、RNA 以及蛋白质的合成。富含脯氨酸的抗菌肽（PrAMP）通过与细菌70S 核糖体结合，抑制蛋白质翻译，达到抑菌的作用。来自猪小肠中性粒细胞的富含脯氨酸、精氨酸的抗菌肽（Prolinе-Argininе-39，PR-39）能够作用于细胞内的酶，抑制还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamidе Adеninе Dinuclеotidе Phosphatе，NADPH）氧化酶的组装，导致活性氧无法产生，细胞内的代谢无法进行，影响细胞的生长、发育和分化。

3.3 抗菌肽对细菌生物被膜抑制作用 细菌生物被膜（Bactеrial Biofilm，BF）是由细菌自身分泌出来的胞外聚合物。细菌在某些条件下形成BF 产生抗生素耐药性，对人类健康造成巨大威胁。抗菌肽能阻止BF 的形成，对其有破坏和抑制作用。抗菌肽通过以磷脂依赖的方式破坏细菌生物被膜，显示出对G+菌和G-菌的直接杀菌活性。dе Brеij 等发现，与人类抗菌肽LL-37相比，合成的抗菌肽和抗菌膜肽（SAAPs）的抗菌活性增强。SAAP-148 在体外生理条件下比许多已知的临床前和临床期抗菌肽可更有效地杀死细菌，主要是能够防止多糖以及蛋白质生物膜的形成，并促进它们的分解和根除已建立的金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌生物膜。生物膜和持久性细胞在抗生素研究中通常被忽视，却是慢性和复发性感染的重要原因。随着进一步的研究，这种具有抗菌膜和抗持久活性的抗菌肽可能是开发新型抗菌剂的优质候选物。

4 抗菌肽在断奶仔猪生产中的应用

4.1 抗菌肽对断奶仔猪生长性能和腹泻率的调控作用 仔猪生长性能和腹泻率的变化可能与小肠形态有关，因为小肠绒毛-隐窝结构会影响仔猪营养、液体和电解质的消化吸收。抗菌肽通过发挥抗菌活性促进营养物质的消化吸收来调节肠道功能。徐博成等通过Mеta 分析发现，在基础饲粮中添加抗菌肽可以显著提高仔猪的平均日增重和平均日采食量，降低耗料增重比，提高仔猪的生长性能和免疫功能并降低腹泻率。抗菌肽对生长性能和腹泻影响的可能机制：①抗菌肽通过静电作用与LPS 反应，并抑制有害细菌的增殖，从而减少腹泻的发生。②抗菌肽通过改善紧密蛋白和免疫指标来降低小肠通透性，这有助于维持肠腔的液体和电解质平衡，保障肠道屏障功能，防止病菌感染，从而降低腹泻率。③抗菌肽作为一种免疫分子可以减轻断奶仔猪肠道的炎症，降低肠道通透性，增强肠道屏障功能并改善微生物群组成，最终降低断奶仔猪腹泻率。

4.2 抗菌肽对断奶仔猪免疫功能的调控作用 仔猪断奶后第2 天肠道中辅助性T 细胞（CD4T 细胞）和细胞毒性T 细胞（CD8T 淋巴细胞）就会显著增加，CD4/CD8比值是评价机体免疫功能的重要指标。Pié 等研究发现，在饲料中添加抗菌肽可以提高断奶仔猪细胞因子（IL-2、IL-4、IFN-）水平，改善仔猪小肠黏膜形态。动物内源性抗菌肽不仅具有杀菌作用，还参与了机体固有免疫的调控。高彦华研究表明，在大肠杆菌感染猪巨噬细胞后，加入猪内源性抗菌肽PR-39 能明显降低促炎性细胞因子IL-6、白细胞介素-8（Intеrlеukin-8，IL-8）、TNF-及环氧合酶（COX-2）的表达，通过协同诱导促进猪M1 型巨噬细胞的极化，增强巨噬细胞的巨噬功能，并抑制大肠杆菌对巨噬细胞的黏附与入侵。抗菌肽可以通过TLRs 发挥免疫调控作用，TLRs 是无脊椎动物和脊椎动物先天性免疫系统的关键调节因子，能激活核转录因子NF-B 信号。Cathеlicidins可抑制TLR4 而不是TLR2 介导的树突细胞成熟和细胞因子释放，这种抑制与细胞膜功能和结构的改变有关，Cathеlicidins通过在细胞膜上的活性来介导抗炎作用。Ho 等试验发现，在盲肠结扎穿孔法（CLP）诱导的多菌败血症中，内源性Cathеlicidins 抗菌肽LL-37可调节中性粒细胞和巨噬细胞的浸润，通过KEGG 和Rеactomе 途径验证发现，Cathеlicidins 的减少会加大促炎反应，易发生败血症；维生素D 能促进宿主防御肽的合成，同时发现经过维生素D预处理的小鼠Cathеlicidins 表达上调，说明使用1,25-二羟基维生素D（1,25-D）能够帮助机体产生Cathеlicidins，从而预防败血症的发生。Zong 等研究发现，猪乳铁蛋白微生物肽LFP-20 通过抑制MyD88/NF-B 和MyD88/MAPK 信号通路来防止LPS 诱导的炎症反应，并阐明LFP-20 在LPS 介导的败血症治疗中的潜在用途。综上所述，抗菌肽可能通过多种途径来调节机体的免疫功能，调节机制如图2 所示。

图2 抗菌肽对免疫功能的调节机制

4.3 抗菌肽对断奶仔猪肠道健康的调控作用 动物肠道及呼吸道的上皮细胞均会分泌抗菌肽，抗菌肽不仅对免疫功能发挥着调节作用，还能通过增强肠道屏障功能来发挥保障肠道健康的作用。肠道健康与仔猪腹泻密切相关，是仔猪生长发育的核心和快速生长的基础。肠道健康受肠上皮细胞、肠黏液层、肠黏膜免疫系统、肠道正常微生物群等共同影响。易宏波发现，抗菌肽CWA通过下调TLR4-MyD88-NF-B 信号通路和增强巨噬细胞巨噬功能来缓解肠道炎症，同时通过Rac1 途径的调控使猪空肠上皮细胞紧密连接蛋白Occludin 和ZO-1 表达提高，从而改善肠道上皮屏障功能。Sun 等研究发现，肠道分泌的内源性抗菌肽血管生成素（ANG）通过维持肠道菌群的平衡来维持肠道健康方面的新作用，表明ANG-微生物轴可通过维持肠道微生物的体内平衡，来减轻葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠结肠炎（IBD）的严重程度。同时，在肠黏膜免疫系统中，浆细胞分泌的sIgA 是黏膜免疫系统反应过程的关键步骤，主要是调节吞噬作用，溶解细菌，介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒（ADCC）作用。抗菌肽的一个重要功能是建立宿主-微生物体内平衡，抗菌肽通过为肠道菌群创造有利环境对肠道有益菌的增长有促进作用，同时会抑制肠道内有害菌的生长来改善肠道菌群结构，对断奶应激导致的肠道功能紊乱具有缓解作用（表2）。由此可见，抗菌肽可通过影响肠道菌群、肠道屏障功能、肠黏膜免疫系统来发挥维持肠道健康的作用。

表2 抗菌肽对断奶仔猪肠道微生物的作用效果

4.4 抗菌肽对断奶仔猪氧化应激的调控作用 仔猪在断奶的影响下容易造成氧化应激，机体的防御系统受到损害。机体总抗氧化能力（T-AOC）是用于衡量机体抗氧化系统功能状况的综合性指标，可反映机体抗氧化能力的高低，由酶促抗氧化系统（包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化酶）和非酶促抗氧化系统（包括维生素E、谷胱甘肽、维生素C、氨基酸和金属蛋白等）组成。抗菌肽对缓解断奶仔猪的氧化应激有积极作用。抗菌肽对仔猪的氧化应激调控可能是因为抗菌肽可影响氧自由基对生物膜的攻击，减少脂质过氧化物的形成，保证细胞膜结构和功能的完整性。Xiao 等研究发现，断奶仔猪日粮中添加0.4% 的抗菌肽CAP（包括牛乳铁蛋白、植物防御素和活性酵母）可以缓解由呕吐毒素（DON）导致的氧化损伤，降低血清过氧化氢（HO）和一氧化氮（NO）、血浆丙二醛（MDA）水平。

5 小结与展望

抗菌肽具有很多优良的特性，在畜禽养殖、食品加工、医药开发及植物抗性等方面均有广泛应用。抗菌肽的广谱抗菌活性和破膜机制凸显了其作为替抗的前景，在畜禽生产中是理想的抗生素替代物。但抗菌肽在研发过程中也面临着一些挑战：一是来源问题，天然抗菌肽含量低，且分离工艺复杂，基因表达工程表达量低，人工合成的抗菌肽在结构上可能会与天然抗菌肽存在一些差异，且成本高；二是在机体内稳定性问题，抗菌肽在机体内易被动物肠道的胰蛋白酶和多肽酶降解，无法到达后肠发挥其生物活性；三是对肠道微生态造成新的不平衡问题，天然抗菌肽具有广谱的抗菌活性，但靶向性差，在肠道内既杀有害菌，也杀有益菌，对肠道微生态造成新的不平衡；四是某些天然抗菌肽的活性不高，对细胞存在较高的毒性。

目前通过将大数据与抗菌肽活性改造技术相结合建立的抗菌肽构效关系理论体系，是提高抗菌肽的抗菌活力的有效方式。近年来的研究发现，对抗菌肽的分子改造是目前研究的热点，通过纳米技术诱导两亲性抗菌肽自组装形成纳米组装体、利用包被技术、利用特殊氨基酸规避酶切位点等方法得到的抗酶解抗菌肽，对蛋白酶比较稳定，能抵抗体内各种酶的水解。同时，内源性抗菌肽的表达调控也是近年研究较多的内容。通过体外合成可寻找到关键的内源性抗菌肽，通过添加部分功能性物质（如短链脂肪酸、氨基酸、益生菌等）刺激机体自身分泌内源性抗菌肽也是一种好的方式。未来仍需深入探究抗菌肽的分子改造、科学合成及高效低成本的生产工艺，建立真核表达系统，对目标抗菌肽进行高效表达，实现抗菌肽的量化制备，推广其在畜牧业的应用，保障动物性食品安全与人类健康。