青藤碱联合顺铂对顺铂耐药Hela细胞株增殖凋亡的作用

王海燕，王钊华，马 波

宫颈癌是临床常见的妇科恶性肿瘤，现已成为全球第四大女性癌症。随着宫颈癌筛查计划的开展及HPV疫苗的推广，部分早期宫颈癌及癌前病变患者得到及时治疗，发病率和病死率都显著降低。对于晚期及复发宫颈癌患者，化疗是最常用的治疗手段。顺铂是最有效的化疗药物之一，以其高效、低毒性的特征，在宫颈癌治疗中发挥重要作用，但其耐药性会降低化疗效果，是晚期及复发宫颈癌患者预后不良的主要原因。青藤碱是从传统中药青风藤中提取的生物碱，常用于治疗风湿性关节炎及神经疼痛，发挥其镇痛、抗炎的功效，且近期研究发现其具有一定抗癌活性。有报道显示，青藤碱可通过抑制卵巢癌细胞活力，诱发细胞凋亡并诱导细胞周期停滞，发挥其抗肿瘤效应。然而，目前关于其对于宫颈癌细胞化疗耐药的作用及相关可能机制鲜有报道。本研究通过建立Hela细胞顺铂耐药模型，研究青藤碱对顺铂耐药性的影响，并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系 人卵巢癌Hela细胞系，购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药物、主要试剂、仪器 青藤碱(纯度≥98%，上海麦克林生化科技有限公司)，Notch通路特异性激活剂Jagged1蛋白(美国MCE公司)，顺铂注射液(江苏豪森药业集团有限公司，国药准字H20040813，规格：30 mg)，MTT试剂盒(上海联硕生物科技有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)全蛋白提取试剂盒(上海研生实业有限公司)，兔抗人神经源性基因Notch同源蛋白1(Neurogenic locus notch homolog protein 1，Notch1)、信号转导及转录激活子3(signal transducer and ac- tivator of transcription 3，STAT3)、发状分裂相关增强子1(hairy and enhancer of split 1，Hes1)蛋白一抗(美国R&D公司)。

Synergy H4全功能酶标仪(美国Bio Tek公司)，Accuri C6流式细胞仪(美国BD公司)，PowerPac Basic电泳仪、Gel Doc XR一体式凝胶成像分析仪(美国Bio-rad公司)

1.3 细胞培养 将人卵巢癌Hela细胞置于DMEM培养液(含有10%胎牛血清、1%青霉素+链霉素双抗)中，标准条件(37 ℃，5% CO)培养箱中传代培养，取对数生长期细胞作为实验对象。

1.4 建立Hela细胞顺铂耐药模型 取对数期Hela细胞加入完全培养液，分别加入不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2 μg/ml)顺铂溶液，1周后耐药性诱导完成。

1.5 MTT法检测不同浓度顺铂对Hela、Hela/顺铂细胞的增殖抑制率 取对数期Hela、Hela/顺铂细胞，加入含顺铂(2、4、8、16、32 μg/ml)DMEM培养液，干预48 h后每孔加20 μl MTT溶液(5.00 g/L)，2 h后弃上清，每孔加150 μl DMSO溶液，振荡10 min，酶标仪检测490 nm吸光度值，计算细胞增殖抑制率(%)=(1-不同浓度顺铂 A值/空白对照A值)×100%，并计算半数抑制浓度(IC)。

1.6 细胞分组、干预取对数期Hela/顺铂细胞，PBS洗涤，调整细胞密度为1×10个/ml，接种于6孔板，待细胞融合至60%，采用简单随机分组的方式分为对照组、青藤碱组、激活剂组、青藤碱联合激活剂组。对照组不处理，青藤碱组加入青藤碱DMSO溶液(40 μmol/L终浓度)，激活剂组加入Jagged1蛋白DMSO溶液(500 ng/ml)，青藤碱联合激活剂组加入青藤碱DMSO溶液(40 μmol/L终浓度)+Jagged1蛋白生理盐水溶液(500 ng/ml)。每组设置5个复孔，干预48 h后继续后续实验。

1.7 MTT法检测不同浓度顺铂对各组细胞的增殖抑制率 取各组细胞，加入含顺铂(2、4、8、16、32 μg/ml)DMEM培养液，同1.5操作，计算细胞增殖抑制率(%)=(1-不同浓度顺铂 A值/空白对照A值)×100%，并计算半数抑制浓度(IC)。

1.8 流式细胞术检测细胞凋亡率 取各组细胞，调整密度至1×10个/ml，接种于6孔板。更换为含8 μg/ml顺铂的DMEM培养液，干预48 h后PBS充分洗涤，2800 r/min离心10 min(离心半径12 cm)，预冷binding buffer标记液重悬细胞，加入5 μl AnnexinV-FITC混合均匀，4 ℃遮光孵育15 min，加入5 μl PI染液染色5 min，过滤，60 min内经流式细胞仪检测细胞凋亡情况，CellQuest软件分析数据。

1.9 Western blot法检测细胞Notch1、Stat3、Hes1蛋白表达 取各组细胞，加入预冷的RIPA裂解液裂解，注入离心管中，3500 r/min离心15 min(离心半径10 cm)，收集沉淀物，采用BCA法定量蛋白。取50 μg待测蛋白，与SDS-PAGE上样缓冲液按1∶5的体积比均匀混合，100 ℃金属浴加热5 min，注入离心管中，8000 r/min离心10 min(离心半径8 cm)，取其上清液，恒压下行上样电泳分离，30 min后经湿转法转膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，TBST洗膜，加入兔抗人Notch1、Stat3、Hes1一抗(1:500)，4 ℃摇床孵育2 h，TBST洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，室温孵育1 h，TBST洗膜，加入ECL发光液显色，暗室曝光，采用一体式凝胶成像系统扫描、分析结果，以Notch1、Stat3、Hes1蛋白与内参GAPDH灰度值比值表示Notch1、Stat3、Hes1蛋白表达量。

2 结 果

2.1 不同浓度顺铂对Hela、Hela/顺铂细胞的增殖抑制率、IC值 不同顺铂浓度对Hela、Hela/顺铂细胞增殖抑制率、IC值细胞间比较，差异均有统计学意义(<0.05)；不同顺铂浓度对Hela/顺铂细胞的增殖抑制率高于Hela细胞，IC值低于Hela细胞(<0.05，表1)。

表1 不同顺铂浓度对Hela、Hela/顺铂细胞增殖抑制率及IC50值比较

2.2 不同浓度顺铂对各组细胞的增殖抑制率、IC值 与对照组比较，青藤碱组不同顺铂浓度对细胞增殖抑制率升高，IC降低，激活剂组不同顺铂浓度对细胞增殖抑制率降低，IC升高(<0.05)；与青藤碱组比较，青藤碱联合激活组不同顺铂浓度对细胞增殖抑制率降低，IC升高(<0.05)；与激活剂组比较，青藤碱联合激活组不同顺铂浓度对细胞增殖抑制率升高，IC降低(<0.05，表2)。

表2 不同顺铂浓度对各组细胞增殖抑制率及IC50值比较

2.3 凋亡率 对照组、青藤碱组、激活剂组、青藤碱联合激活组凋亡率分别为(11.59±1.33)%、(24.68±3.96)%、(3.57±0.45)%、(16.12±3.01)%，与对照组比较，青藤碱组凋亡率升高(<0.05)，激活剂组凋亡率降低(<0.05)；与青藤碱组比较，青藤碱联合激活组凋亡率降低(<0.05)；与激活剂组比较，青藤碱联合激活组凋亡率升高(<0.05，图1)。

图1 各组Hela细胞凋亡流式图

2.4 细胞Notch1、Stat3、Hes1蛋白表达 与对照组比较，青藤碱组Notch1、Stat3、Hes1蛋白表达量降低(<0.05)，激活剂组Notch1、Stat3、Hes1蛋白表达量升高(<0.05)；与青藤碱组比较，青藤碱联合激活剂组Notch1、Stat3、Hes1蛋白表达量升高(<0.05)；与激活剂组比较，ATL联合转染组Notch1、Stat3、Hes1蛋白表达量降低(<0.05，表3，图2)。

表3 各组细胞Notch1、Stat3、Hes1蛋白表达量比较

图2 Western Blot法检测各组Notch1、Stat3、Hes1蛋白表达量

3 讨 论

宫颈癌是发生在子宫阴道部及宫颈管的恶性肿瘤，多产生于子宫颈黏膜上皮层内，后侵入黏膜下间质，逐步进展为肿瘤侵入阴道及生殖器官。其早期症状与宫颈炎相似，表现为阴道接触性出血及阴道排液增多，后期则表现为输尿管梗阻、肾盂积水，严重时可引发尿毒症。性生活过早、患有性传播疾病、病毒或真菌感染等均是其危险因素。晚期及复发宫颈癌患者通常采用以化疗为主的非手术治疗方式。癌细胞在顺铂的长期作用下，会产生抵抗适应性反应，顺铂对癌细胞的细胞毒性降低，产生耐药性。目前关于宫颈癌细胞顺铂耐药机制尚不明确，通常认为与DNA修复功能增强、顺铂在癌细胞内积累过少、抗凋亡相关通路激活及细胞自噬功能减弱有关。因此，探寻宫颈癌细胞化疗耐药性的原因，寻找有效提升顺铂敏感性的治疗手段，对于提高化疗成功率、改善患者预后意义重大。

顺铂类化疗药物为攻伐之品，易耗气伤阴，导致脏器亏损、脾胃虚弱、气血不足等证，虽然抑制了肿瘤生长，但对机体也造成损伤。近年来发现的抗癌新药物大多与中草药有关，部分中草药提取物可发挥抗肿瘤及改善肿瘤细胞耐药性的功效，已成为临床研究热点。青风藤是《本草纲目》《本草图经》等多个古代医书记载的传统中草药，取自防己科植物青藤、毛青藤藤茎，性平，味苦、辛，归肝、脾经，可舒筋活血，正骨利髓。青藤碱是其主要活性物质，具有抗癌、抗病毒、抗血管生成、保护器官损伤等作用。本研究结果显示，与对照组比较，青藤碱组不同顺铂浓度对细胞增殖抑制率、IC均升高，凋亡率升高，提示青藤碱可减弱宫颈癌细胞化疗耐药性，促进细胞凋亡。Chen等研究认为，青藤碱通过激活细胞凋亡相关信号通路，减弱人膀胱癌253J细胞化疗多药耐药性，本研究结果与其相似。

Notch信号通路是机体内高度保守的信号通路，由受体、配体、DNA结合蛋白及效应分子组成，参与增殖、凋亡等细胞生物学过程，Notch1是其受体蛋白，与Notch配体结合后被金属蛋白酶分解生成亚基NEC，在γ-分泌酶的作用下，产生Notch胞内段，其直接进入细胞核与转录因子结合，作用于下游靶基因Hes1，促进其转录，从而发挥其生物学效应。STAT家族是JAKs下游底物蛋白，主要存在于细胞质中，作为关键激活转录因子参与癌细胞增殖、自噬、凋亡等多种生理过程，STAT3是细胞信号传导与激活转录因子，广泛分布于多种细胞质中，被细胞因子受体激活后形成二聚体，转移至细胞核与相关基因序列结合，转录下游靶基因，与Notch信号通路串联，共同作用调控肿瘤细胞化疗敏感性。有研究表明，下调STAT3、Notch1基因可提高耐药性MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞系化疗敏感性。本研究结果显示，与对照组比较，青藤碱组Notch1、Stat3、Hes1蛋白表达量降低，且在青藤碱的基础上增加Notch通路特异性激活剂Jagged1蛋白可减弱青藤碱对宫颈癌细胞的化疗增敏作用，提示青藤碱可能通过介导该通路，促进细胞凋亡，从而降低宫颈癌细胞化疗耐药性。

综上所述，青藤碱可提高化疗药物对宫颈癌细胞的增殖抑制率，并促进其凋亡，从而减弱宫颈癌细胞化疗耐药性，可能通过抑制Notch1/STAT3信号通路来实现。