过表达BAS1延迟转基因矮牵牛衰老

姚新转 张宝会 陈湖芳 吕立堂

摘要：油菜素类固醇（BRs）是必不可少的植物激素，在植物的生长、繁殖以及逆境响应中发挥重要作用。为了验证该基因的功能，本文构建了植物遗传表达载体，利用农杆菌介导遗传转化法遗传转化矮牵牛，获得29 株转基因植株;转基因植物表现为节间缩短，分枝增多，生长后期表现出叶片延迟衰老;叶绿素含量、可溶性总糖含量、酶活明显高于野生型， MDA 含量明显低于野生型;BAS1基因在矮牵牛中的超表达可以提高矮牵牛植株中衰老相关基因的表达，从而延缓了转基因矮牵牛的衰老。因此，BAS1可用作调控植物花衰老和延长花寿命的潜在候选基因。

关键词：BAS1基因;矮牵牛;抗氧化酶活性;相关基因表达;衰老

中图分类号：Q812

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2022）02-0038-006

国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2022.02.006

BAS1基因编码具有羟化酶活性的细胞色素P450单加氧酶，该酶催化油菜素固醇（BR）C-26的羟基羟化作用，导致BR生理活性的降低或丧失[1]。作为成年植物，BR突变体基本上表现出缺少红光受体phyB突变体的相反表型。 BR突变体是深绿色，生长缓慢，叶片萎缩且茎短小。另外，BAS1突变体表现出延迟衰老[2]。过表达BAS1的转基因植物显著降低BR含量，从而导致叶片萎缩，叶片深绿和茎短[3-4]。BAS1过表达诱导的叶片衰老与烟草植物中细胞分裂素过表达导致的表型非常相似。

异戊烯基转移酶（IPT）催化细胞分裂素合成的限速步骤。 Gan等[5]研究表明，通过精确控制IPT表达来引发特定的发育反应。SAG12启动子仅在衰老开始时才激活IPT表达，这种激活导致衰老过程的抑制[5-6]。通过IPT表达抑制叶片衰老导致衰老特异性启动子的减弱[7]，从而防止了细胞分裂素的过量产生，干扰了发育的其他方面[8]。在SAG12-IPT烟草中，叶片的衰老得到了有效控制，而没有其他发育异常[9]。随后，该方法成功用于水稻[10]、花椰菜[11]、矮牵牛[12]和生菜[13]。

姚新转等[14]使用衰老特异性SAG12启动子驱动烟草中BAS1表达，发现转SAG12-BAS1基因植物和野生型植物的生长相似。然而，转基因烟草叶片显示出延迟衰老的特性，主要表现为植物叶片呈深绿色、叶绿素含量增加、保护酶活性增加、细胞分裂素含量增加、叶片绿色滞留时间延长和延迟的衰老[14]。本研究构建了植物遗传表达载体，利用农杆菌介导遗传转化法遗传转化矮牵牛衰老延迟，为研究园艺植物奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

矮牵牛植物均在贵州大学农业生物工程研究所的温室中生長。PCR引物由上海生工生物技术有限公司合成。其他化学试剂为国产或进口的分析纯化学品。

1.2矮牵牛的遗传转化及转基因植物鉴定

利用叶盘转化法进行遗传转化[15]。经GUS组织化学染色和PCR鉴定，获得转BAS1基因矮牵牛，转BAS1基因矮牵牛出现三种表型（如图2，按叶片性状分为表型1：TP28;表型2：TP40;表型3：TP41），本试验选择具有相似表型的野生型WT和转基因植物表型1用于随后的试验。

1.3生理指标的测定

利用分光光度法（721可见分光光度计）测定超氧化物歧化酶（SOD），过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性和丙二醛（MDA）、叶绿素、可溶性糖含量。按照试剂盒说明书进行操作（苏州科铭生物技术有限公司）。

1.4矮牵牛叶片相关基因表达分析

总RNA提取，根据试剂盒说明书反转成cDNA。使用ABI 7500实时PCR系统（美国应用生物系统公司）进行定量RT-PCR。通过使用QuantiNova SYBR Green PCR试剂盒（目录号208054;Qiagen，德国）进行荧光定量分析，按照2-△△CT法计算和分析基因的表达水平。每个试验3次重复，引物序列见表1。

1.5统计分析

使用Excel 2017软件（Microsoft，Redmond，USA）和SPSS Statistics 22.0软件进行统计分析，结果表示为平均值±标准差（SD）。

2结果与分析

2.1农杆菌介导的矮牵牛遗传转化与转基因植株获得

在植株 3～5叶期对野生型矮牵牛和抗性矮牵牛的叶片进行 GUS 组织化学染色，结果显示野生型矮牵牛植株未检测到 GUS 活性，抗性矮牵牛植株中检测到了 GUS 活性（图1-a）。分别提取野生型矮牵牛和 GUS 组织化学染色阳性矮牵牛植株的 DNA，以BAS1基因引物进行 PCR 检测，在野生型矮牵牛植株中未扩增出目的条带，而转基因植株中获得了预期的 419 bp 的目的条带。证明外源BAS1基因已成功整合到矮牵牛基因组中（图1-b）。

2.2 矮牵牛植物表型以及BAS1基因的表达分析

野生型和转基因矮牵牛在相同条件下生长，观察到转基因矮牵牛有三种表型（图2-a）。转基因植物表型1和野生型表型相似（本试验选择表型1进行后续试验，包括TP12，TP28和TP38）。与野生型（WT）植物相比，SAG12-BAS1转基因植物（表型2和表型3）表现出较矮小，生长缓慢，较深的绿叶和延迟衰老。表型3显示最深的绿叶。表型2和表型3中的启动子可能未受到严格控制，类似于转基因植物中的IPT过表达表型（图2-a）。图2-b显示了三种转基因植物中BAS1基因表达的分析。在表型1和表型2植物中BAS1基因的表达相似，而在表型3中BAS1基因的表达更高（图2-b）。

2.3 SAG12-BAS1转基因矮牵牛的叶和花衰老

SAG12-BAS1转基因矮牵牛的开花时间为11 d，而野生矮牵牛的开花时间仅为5 d（图3-a）。生长70 d后，带有转基因SAG12-BAS1基因的植物被深绿色的叶子完全覆盖，而野生矮牵牛的叶子为黄色，没有新的叶子生长。105 d后，WT矮牵牛植物的叶中央部分明显发黄，而转基因植物不明显（图3-b）。WT矮牵牛几乎死了，只有几片黄色的叶子，而转基因矮牵牛正常的生长和发育。因此，与野生型植物相比，转基因植物的衰老被延迟了超过10～15 d。与野生矮牵牛相比，转基因矮牵牛具有更多的分支，更短的茎和更多的花。

2.4转SAG12-BASA1基因对矮牵牛生理指标的影响

转基因矮牵牛的叶绿素和可溶性糖含量（平均值）分别比野生型高42.89%和116.8%（图4）（P<0.05）。转基因矮牵牛的SOD，POD和CAT活性（平均值）分别比野生矮牵牛高82.74%，131.8%和135%。转基因矮牵牛的MDA含量（平均值）比野生矮牵牛的MDA含量低46%（图5）。因此，在转基因植物中保护酶的活性得到增强，提高了活性氧清除和防止膜脂质过氧化以及减少MDA积累。SAG12-BAS1基因的表达增强了矮牵牛植物的抗氧化能力，从而降低了植物膜被破坏的程度，同时提高了植物的抗逆性。

2.5 转基因株系BAS1基因表达及相关基因的表达

BAS1基因在矮牵牛中表达以及相关基因表达如图6所示。结果表明，与野生型植物相比，转基因植物中调节细胞分裂素 PhARR2基因和细胞分裂素受体组氨酸蛋白激酶 PhHK的平均表达量分别显著增加了2.35倍和2.41倍。与野生型植物相比，矮牵牛 PhGA2ox1和PhGA2ox3的表达在转基因植物中更显著（分别为11倍和3倍）（P<0.01）。与野生型植物相比，转基因植物中的生长素应答因子 PhARF4基因表达水平降低了0.74倍。

3结论与讨论

植物衰老是一个受基因调控的高度复杂和有序的过程，具有多层次、多途径的特点，叶片衰老是植物衰老的主要表现形式[16-18]。本研究结果表明，转基因矮牵牛延长了10～15 d，同时，影响叶片的衰老信号和保护酶SOD、POD和CAT的活性，与野生矮牵牛相比，转基因矮牵牛叶片中的SOD，POD和CAT活性都提高了。在植物衰老期间，SAG12-BAS1基因的表达提高了植物中保护酶的活性并增强了除氧活性。与野生型相比，转基因矮牵牛的MDA含量低46%，表明转基因矮牵牛的细胞膜未受到破坏。此外，转基因矮牵牛叶中的叶绿素和可溶性糖含量高于野生型植物。

拟南芥应答调节器（ARR）基因家族的A型成员的过表达可以产生负作用调节细胞分裂素途径[19]。在本研究中，PhARR2在转基因植物中的表达增加比野生植物提高了2.35倍，表明ARR2正调控细胞分裂素的水平。细胞分裂素受體组氨酸激酶AHK2，AHK3和CREI/AHK4/WOODEN LEG（WOL）与细胞分裂素结合并自磷酸化[20]。随后经过其他过程进入细胞核并将磷酸基团转移到一系列ARR中调节下游细胞分裂素的反应，并产生了一系列调节植物生长和发育的生化作用[21]。试验结果表明，与野生型相比，转基因矮牵牛中PhAHK的平均表达高2.41倍。 GA2ox表达降低内源GA3浓度不仅导致植物矮化，而且改变了种子休眠时间和叶绿素浓度[22]。结果表明，与野生型相比，转基因矮牵牛中PhGA2ox1和PhGA2ox3的平均表达分别增加了11倍和3倍。在这项研究中，与野生型矮牵牛植物相比，转基因矮牵牛中的PhARF4基因表达被下调，这表明ARF转录因子抑制了植物生长素信号转导途径。

总之，研究表明，在正常状态下生长的SAG12-BAS1转基因株系表现出一系列表型变化，包括花蕾数增加，分支和节间长度增加，开花延迟，保护酶活性增加以及BAS1相关基因的表达变化，衰老相关基因的调控可能会增加细胞分裂，降低乙烯含量，并延缓矮牵牛的衰老。但是，作用机理仍不清楚，需要进一步研究。

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Over-Expression of the BAS1 Gene to Delay Senescence in Transgenic Petunia hybrida

Yao Xinzhuan1，Zhang Baohui1，Chen Hufang1，Lv Litang1，2*

（1.College of Tea Science，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;2.The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region （Ministry of Education）/Institute of Agro-Bioengineering，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：Brassinosteroids （BRs） are essential hormones that play an important role in plant growth，reproduction and response to adversity.In order to verify the function of the gene，a plant genetic expression vector was constructed in this paper.Agrobacterium-mediated genetic transformation was used to genetically transform petunia to obtain 29 transgenic plants.The transgenic plants showed shortened internodes，increased branches，and obviously delayed leaf senescencein the late growth period.Transgenic petunia chlorophyll content，total soluble sugar content，and enzyme activity were significantly higher than wild-type，and MDA content of transgenic plants was significantly lower than wildtype.Overexpression of BAS1 gene in petunia can increase the expression of senescence-related genes in petunia plants，thereby prolonging the senescence of transgenic petunia.Therefore，BAS1 can be used as a potential candidate gene for regulating plant flower senescence and extending flower life.

Keywords： BAS1 gene;Petunia hybrida ;antioxidant enzyme activity;related gene expression;senescence

收稿日期：2021-05-06;

修回日期：2021-08-31

基金項目：贵州茶产业技术创新中心（黔科中引第[2017] 4005）

通讯作者：吕立堂（1977—），男，博士，教授，主要从事茶树生物学和基因工程方面的研究，E-mail：ltlv@gzu.edu.cn.

1857501705307