乳酸菌对苏尼特羊生长性能、肉品质及肠道微生物的影响

王宏迪，窦 露，王柏辉，刘 婷，段 艳，孙立娜，张琳璐，乌兰花，靳 烨

(1. 内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特 010018; 2. 乌拉特中旗农牧和科技局，内蒙古 乌拉特中旗 015300)

【研究意义】长期在草场自由采食天然牧草的苏尼特羊，有着抗逆性强、发育迅速、羊肉膻味轻、脂肪含量低及氨基酸含量高、种类齐全等优点[1]。但随着国家退牧还草政策的实施，大部分牧区逐渐由放牧饲养向集约化和规模化养殖转变，这种转变虽然缩短了羊的出栏时间，但却对羊肉品质产生了不利影响，因此如何改善舍饲羊肉品质成为研究热点。【前人研究进展】肠道菌群的组成往往会受遗传背景、环境、年龄、性别、食物和药物等多种因素的影响[2]。研究发现，饲粮是影响肠道菌群内生物多样性或改变特定细菌种类水平的主要因素，并且随着动物的生长发育，肠道微生物菌群的结构也会发生动态变化，从而影响机体对食物和养分的消化吸收等多种生理功能[3-4]。益生菌作为抗生素的天然替代品，在我国已有乳酸杆菌等16种农业部准许使用的微生物饲料添加剂，其不仅可以避免动物产生抗药性的潜在风险以及动物产品(如肉、蛋和奶)中的抗生素残留，还能通过限制病原体的侵入来增强肠道健康，从而有助于提高饲料转化率，改善动物的身体生长和营养性能等功效[5-6]。有研究发现饲粮中添加菊粉会通过促进乳酸菌的生长，增加肠道对矿物质的吸收(通过体外研究可以提高铁、锌、镁和钙离子的吸收)，提高宿主的免疫系统进而提高了猪的生长性能[7]。白艳苹等[8]研究发现植物乳杆菌可有效提高苏尼特羊肌肉的抗氧化能力和肌纤维特性，改善肉品质。Jia等[9]用乳酸菌复合生物制剂喂养育肥羔羊，发现其生长性能、机体抗氧化能力及免疫功能均有明显改善，且瘤胃微生物多样性也显著增加。【本研究切入点】关于乳酸菌对苏尼特羊生长性能、屠宰性能、肉品质的影响和饲喂周期内肠道微生物的变化研究较少。肠道作为机体的第二大脑，其中栖息着的大量微生物形成了繁杂的肠道微生态系统[10]，这些微生物对机体生长发育起着重要的作用[11]。【拟解决的关键问题】本研究首次通过研究乳酸菌对苏尼特羊饲喂周期内生长性能、屠宰性能、肠道微生物及肉品质的影响，以期为乳酸菌饲料开发和改善舍饲羊生产性能提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

在内蒙古巴彦淖尔市乌拉特中旗哈拉图嘎查顺遂农牧农业合作社(41°35′16.8″N，108°30′50.4″E)挑选12只健康无病的3月龄纯种苏尼特羊[平均体重为(18.83±2.44)kg]，公母各6只，分别按体重大小进行编号，采用配对随机单位组试验设计，分为对照组和试验组，每组6只(公母各3只)。采用半封闭式饲养模式，对照组饲喂基础日粮(精料和粗饲料)，不含任何抗生素，试验组在对照组的基础上添加乳酸菌，其添加量为基础日粮中精料的2%，参考NY/T 816—2004中国肉羊饲养标准来配制日粮，精粗比为60∶40，精料组成及营养水平见表1，粗料为玉米秸秆和干草。

每日饲喂2次饲粮，早晚各1次，自由采食和饮水，随着个体日龄的增加，其饲喂的精料重量有所增加，0～30 d每日饲喂200 g精料，30 ～60 d每日饲喂400 g精料，60 ～90 d每日饲喂600 g精料。乳酸菌在每天20:00左右灌喂，以200 g精料为例计算每日乳酸菌添加量：200 g×2%×6只=28 g，以105 mL水混匀，用20 mL注射器吸取15 mL注射到羊口中，所有个体的饲养环境和管理条件均一致，预饲期为7 d，正式试验饲喂时间持续90 d。

乳酸菌为内蒙古和美科盛生物技术有限公司提供的乳安邦复合微生态制剂，成分为干酪乳杆菌HM-09、植物乳杆菌HM-10及乳酸菌代谢产物，总活菌数达1.5×109CFU/g。

1.2 生长性能测定

本研究测定的生长性能包含活体重(测定时个体的重量)、增重和平均日增重，具体测定时间为开始试验时以及试验后的30、60和90 d，测定前空腹24 h，自由饮水。

表1 精料组成及营养水平(风干基础)

1.3 屠宰性能测定

饲喂90 d后进行屠宰，屠宰前空腹静养12 h、停水2 h，根据现行国家标准《鲜、冻胴体羊肉》(GB/T 9961—2008)对苏尼特羊胴体进行分割，测量并计算屠宰性能等指标，具体指标包括骨重、净肉重、屠宰率、产肉率、骨肉比、胴体重、背膘厚和眼肌面积。

1.4 肉品质测定

(1)色泽测定：在屠宰后的1～2 h内使用TC-P2A全自动测色色差仪测定背最长肌的亮度值(L*)、红度值(a*)和黄度值(b*)。

(2)pH测定：使用pH-STAR型胴体pH直测仪测定背最长肌的pH0(宰后45 min羊肉的pH)和pH24(4 ℃静置排酸24 h羊肉的pH)。

(3)蒸煮损失率测定：屠宰后2 h内取50 g左右背最长肌整块肉样，去除表面的筋、腱、膜及脂肪后称重(m1)，放入75 ℃水浴锅中煮45 min，取出冷却至室温并擦干后称重(m2)。

(4)嫩度测定：将沿肌纤维方向切好的肉条(3 cm×1 cm×1 cm)用自封袋密封后，放入85 ℃水浴锅中煮40 min，取出冷却至室温并擦干后用C-LM3B型数显式肌肉嫩度仪测定剪切力值。

1.5 肠道微生物的测定

在试验开始(第0天)以及试验后的第30、60和90天分别采集新鲜粪便样品按个体编号于冻存管-80 ℃保存，进行如下试验步骤。

总DNA提取：根据DNA提取试剂盒操作步骤对样本进行总DNA提取，用NanoDrop2000检测总DNA浓度和纯度，并用2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性和质量，于-20 ℃保存待测。

PCR扩增：使用515F和926R细菌通用引物对16 sRNA基因的V4～V5区间进行PCR扩增。

菌群高通量测序：使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，并进行纯化洗脱和电泳检测，利用QuantiFluorTM-ST检测定量，根据Illumina Miseq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建完整文库并利用Illumina Miseq平台测序。

1.6 数据分析

利用SPSS 18.0软件对第0、30、60和90天测定的生长性能、屠宰性能、肉品质指标和肠道微生物菌群多样性以及OUT值数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和多重比较分析(Duncan’s)。对于测序获得的肠道微生物菌群数据，使用FastTree软件分析群落Alpha多样性，进一步对菌群构成的丰度和多样性进行评价，各组样本的丰度值(OTU)基于加权遗传距离矩阵(Weighted unifrac distance)进行PCoA分析。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌对苏尼特羊生长性能的影响

为探究乳酸菌对苏尼特羊生长性能的影响，对第30、60和90天试验羊的活体重、增重和平均日增重进行方差分析。由表2可知，与对照组相比，试验组第30和第90天的总增重和平均日增重显著提高(P<0.05)，第60天时两组的总增重和平均日增重表现为试验组高于对照组(P>0.05)。

表2 乳酸菌对生长性能的影响

2.2 乳酸菌对苏尼特羊屠宰性能的影响

为探究乳酸菌对苏尼特羊屠宰性能的影响，对个体饲喂90天屠宰后测定的屠宰性能进行方差分析。由表3可知，试验组的骨肉比和眼肌面积显著高于对照组(P<0.05)，除此之外，乳酸菌对其他屠宰性能均无显著影响(P>0.05)。

表3 乳酸菌对屠宰性能的影响

2.3 乳酸菌对苏尼特羊肉品质的影响

为探究乳酸菌对苏尼特羊肉品质的影响，对背最长肌的肉品质指标进行测定和方差分析。由表4可知，试验组的pH24显著高于对照组(P<0.05)，蒸煮损失极显著低于对照组(P<0.01)，除此之外乳酸菌对其他肉品质指标均无显著影响(P>0.05)。

表4 乳酸菌对肉品质的影响

2.4 乳酸菌对苏尼特羊肠道微生物多样性的影响

2.4.1 α多样性分析 由表5所示，在饲喂周期内试验组的Chao1和Ace指数均显著高于对照组(P<0.05)，在饲喂第30和第90天，Shannon指数均显著高于对照组(P<0.05)，而Simpson指数与之相反。所有样本Coverage指数都高于99%，说明本次测序数据量足以覆盖样本中的绝大多数物种。

表5 肠道微生物α多样性分析

2.4.2 β多样性分析 为探究试验组与对照组肠道微生物群落组成的差异性，在OTU水平，基于加权遗传距离矩阵(Weighted Unifrac distance)进行PCoA分析。结果(图1-A)表明，试验组与对照组的微生物群落各聚为一类，且能够明显分开，表明组内相似程度要高于组间。对试验组的第0、30、60和90天样品基于 OTU 水平，进行加权遗传距离矩阵(Weighted Unifrac distance)计算和PCoA分析。由图1-B可知，第0、30、60和90天样品也能够完全区分，表明饲喂乳酸菌对苏尼特羊肠道微生物有显著影响，并且在饲喂过程中随着时间的变化肠道微生物也存在动态变化。

C(R)0：对照组(试验组)第0天；C(R)1：对照组(试验组)第30天；C(R)2：对照组(试验组)第60天；C(R)3：对照组(试验组)第90天C(R)0:The 0th day of the control group (test group)；C(R)1:The 30th day of the control group (test group)；C(R)2:The 60th day of the control group (test group)；C(R)3:The 90th day of the control group (test group) 图1 基于加权遗传矩进行PCoA分析Fig.1 PCoA analysis based on matrix calculation by Weighted UniFrac distance

2.5 乳酸菌对苏尼特羊肠道微生物菌群结构的影响

2.5.1 门水平上的肠道微生物菌群结构分析 在门水平上共检测出23种微生物，主要以厚壁菌门(Firmicute)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主，占总菌的75%以上，其次为螺旋体门(Spirochaetes)、变形菌门(Proteobacteria)等。对相对丰度值较高的厚壁菌门、拟杆菌门、螺旋体门和变形菌门进行统计分析，结果如表6所示。试验组第30和第90天厚壁菌门的丰度值显著高于对照组(P<0.05)，而第30天拟杆菌门的丰度值和第30和第90天变形菌门丰度值显著低于对照组(P<0.05)。

表6 门水平上的肠道微生物菌群结构分析

2.5.2 属水平上的肠道微生物菌群结构分析 在属水平上共检测出375种细菌微生物，相对丰度值较高的细菌主要是瘤胃菌科_UCG_005(Ruminococcaceae_UCG_005)、瘤胃菌科_UCG_010(Ruminococcaceae_UCG_010)、拟杆菌属(Bacteroides)、未分类毛螺菌属(Unclassified_f__Lachnospiraceae)等。

对属水平相对丰度值前12的物种进行统计分析，结果如表7所示。试验组饲喂第30天，瘤胃菌科_UCG-010、克里斯滕森菌科_R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、未分类毛螺菌属、另枝菌属(Alistipes)、理研菌科RC9肠群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)的丰度值均显著高于对照组，而琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)的丰度值显著低于对照组(P<0.05)。试验组第60天，瘤胃菌科_UCG-010、未分类毛螺菌属、普雷沃氏菌属_1(Prevotella_1)的丰度值显著高于对照组(P<0.05)。试验组第90天，拟杆菌属、另枝菌属、普雷沃氏菌属_1、密螺旋体属_2(Treponema_2)的丰度值显著高于对照组，而琥珀酸弧菌属丰度值显著低于对照组(P<0.05)。

表7 属水平上的肠道微生物菌群结构分析

3 讨 论

3.1 乳酸菌对苏尼特羊生长性能的影响

饲料添加剂会塑造动物胃肠道内的微生物菌群，影响动物的健康，并提高营养物质的利用。Casper等[12]给新生犊牛饲喂植物乳杆菌，提高了42 d和56 d的日增重，改善了其肠道健康和生长性能。董改香等[13]用益生菌发酵香草配合饲料饲喂育肥羊150 d，发现其可以显著提高育肥羊平均日增重。王珍珊等[14]用嗜酸乳杆菌微胶囊制剂饲喂杜寒肉羊60 d，发现其平均日增重显著提高。张君胜等[15]用复合芽孢杆菌制剂饲喂猪35 d后，极显著提高了仔猪日增重。本研究发现，乳酸菌显著提高了苏尼特羊30和90 d的总增重和平均日增重。乳酸菌会通过发酵碳水化合物形成乳酸，在厌氧环境中激发胃蛋白酶并分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等活性物质[16]以及产生必需氨基酸和维生素等多种有机物质[17]，从而调节动物肠道的pH使肠道区系处于动态平衡，影响苏尼特羊肠道微生物群落结构，促进对不同食物的消化和吸收，提高了苏尼特羊生长性能[18]。动物一般的生长规律是随着年龄的增长，体重等各身体要素都会不断增加，直到达到一定程度，在本研究的饲喂周期中，随着月龄的增加，苏尼特羊体重、增重和平均日增重也不断增加，直到达到一定阶段后保持一个相对稳定的水平。

3.2 乳酸菌对苏尼特羊屠宰性能的影响

动物的日常饲养管理水平、日龄、环境和饲粮添加剂等可直接影响畜禽的屠宰性能，进而影响到养殖的经济效益。张天阳[19]研究发现，乳酸菌能提升生长育肥猪的眼肌面积。侯改凤等[20]通过研究也发现，饲喂乳酸菌有提高眼肌面积的趋势，眼肌面积的大小与肉用羊胴体品质的优劣呈正相关。本试验结果亦表明，乳酸菌可显著提高苏尼特羊的骨肉比和眼肌面积。这可能由于乳酸菌在厌氧环境下会利用碳水化合物产生乳酸等多种活性物质促进了脂肪分解，抑制了糖类物质的氧化，从而提高了屠宰性能。

3.3 乳酸菌对苏尼特羊肉品质的影响

肌肉pH可以反映宰后肌肉糖酵解的程度，其与肉的色泽、嫩度、适口性和持水能力等特性密切相关[21]。正常宰后肌肉的pH0在6～7，pH24为5.7左右。本试验中苏尼特羊肌肉的pH0和pH24均在正常范围内，且试验组的pH24显著高于对照组，这可能是因为添加乳酸菌后提高了肌肉中抗氧化活性以及减弱了肌肉细胞的无氧酵解，能够有效避免产生PSE或酸性肉[22]。蒸煮损失率通常能间接反映肌肉的持水能力，剪切力则是评估肉类嫩度的最常用指标。本研究中试验组的蒸煮损失极显著低于对照组，这与Dowarah等[23]和罗鹏等[24]研究发现日粮补充乳酸菌后提高动物肌肉的持水能力和改善肉的嫩度结果相一致。乳酸菌会影响肠道中微生物多样性和菌群结构，提高畜禽对营养物质的消化吸收，并促进了肌纤维类型的转化，进而改善肉品质。

3.4 乳酸菌对苏尼特羊肠道微生物多样性的影响

在哺乳动物的生命过程中，肠道微生物菌群始终处于动态变化中，并随着外界环境、饮食或年龄的改变，肠道的平衡区系也随之改变。已有研究表明生长性能与肠道菌群的多样性呈显著正相关，并表明通常高丰富度的微生物群落能够使宿主更好的发挥肠道功能，更高效地消化分解摄入的食物[25]。本研究发现饲喂乳酸菌显著提高了肠道微生物的均匀度和丰富度，说明添加乳酸菌可通过改善肠道微生物进而提高生长性能和屠宰性能。饲喂周期内第30天时多样性最高，这可能是由于外界环境的变化和饲料变更导致肠道菌群体系发生变化，30 d后肠道微生物多样性趋于平衡和稳定。陈宝剑等[26]研究结果发现，仔猪断奶后随着日龄的不断增加，肠道微生物多样性趋于稳定。并且饲喂过程中肠道微生物存在动态变化，这与王磊等[27]和刘韶娜等[28]的研究结果一致。通过PCoA分析发现，两组间样品明显成分组聚类，在饲喂周期内各阶段的样品也能够完全区分，说明这两组的菌群分别具有较高的稳定性且在微生物结构上具有较大差异，而且随着日龄和饮食的变更，苏尼特羊肠道微生物区系也在不断的建立与完善。

3.5 乳酸菌对苏尼特羊肠道微生物菌群结构的影响

厚壁菌门和拟杆菌门是动物肠道中重要微生物。在门水平上，苏尼特羊胃肠道中厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌门，占75%以上，且厚壁菌门的丰度值高于拟杆菌门，这与Wang等[29]和曾燕等[30]的研究结果相同。饲喂乳酸菌后厚壁菌门的丰度值升高，有利于帮助肠道降解纤维，分解代谢蛋白质和脂肪，产生更多的短链脂肪酸和脂质产物，促进机体脂质的沉积[31]。Turnbaugh等[32]研究发现体格较小的小鼠肠道中拟杆菌门丰度值较高，而强壮的小鼠肠道中则富含厚壁菌门，这与本研究的结果一致，即试验组的增重量高于对照组。因此，通过调控肠道微生物中厚壁菌门和拟杆菌门的比例可有利于增加动物的生长性能。变形菌门是肠道的主要病原菌，可引起动物腹泻等肠道疾病，也是鉴定哺乳动物肠道健康的关键标志，其数量与肠道健康状态成反比[33]。本研究中饲喂乳酸菌后变形菌门的相对丰度逐渐降低，进一步表明添加乳酸菌可能会抑制肠道致病菌，改善肠道环境，降低苏尼特羊肠道患病的风险，这与Li等[34]的研究结果一致，其表明饲喂小鼠枯草芽孢杆菌，变形菌门的丰富度下降，厚壁菌门的丰富度升高。

在属水平上，试验组中的瘤胃菌科_UCG-010显著高于对照组。反刍动物能够高效利用纤维性饲料作为其主要能量来源，其主要的原因是通过瘤胃微生物对纤维性饲料进行降解与转化，其中最主要的纤维分解菌之一就是瘤胃菌科。瘤胃菌科帮助宿主降解饮食中的半纤维素和纤维素等难消化碳水化合物，产生机体和上皮组织的重要营养物质短链脂肪酸，比如丁酸[35]。丁酸已被证明对哺乳动物的肠道发育和维持肠道健康有益，并具有免疫防御功能，产生丁酸的主要细菌是厌氧菌，而肠道中较低的氧气浓度为厌氧菌创造了有利环境，同时，被上皮吸收和代谢的丁酸可以消耗肠道中氧气，从而稳定缺氧诱导因子(HIF，一种协调屏障保护的转录因子)，保护上皮的屏障功能[36]。试验组中瘤胃菌科的丰度显著提高，表明苏尼特羊对植物多糖的分解效率提高，产生较多的丁酸，维持肠道健康。

另枝菌属属于理研菌科，本研究中试验组的丰度显著高于对照组(P<0.05)。目前，另枝菌属作为生物肠道微生物的优势菌，研究证实三叶鬼针草作为益生元，可提高该菌的相对丰度，改善了鸡群健康；饲料添加壳寡糖可提高该菌相对丰度，改善了抗生素处理导致的鸡肠道微生物区系紊乱。理研菌科RC9肠群也是理研菌科重要的种属，其在脂肪沉积中起到重要作用。王柏辉等[37]研究表明理研菌科RC9肠群与肌肉中亚麻酸代谢有密切联系。赵彦光等[38]证实了乳酸菌的添加显著提高了猪肠道中抗病菌理研菌科RC9肠群的相对丰度，提高肠道菌群对纤维的消化作用，与本研究结果一致。

普雷沃氏菌属_1属于革兰阴性杆菌，专性厌氧菌，具有独特的粘蛋白糖蛋白降解能力，可降解半纤维素和木聚糖等多类营养物质[39]。有研究表明普雷沃氏菌属在人体肠道中是条件致病菌，与牙周炎和类风湿关节炎等多种炎症性疾病有关[40-41]，这可能是动物体的差异和遗传背景不同而发挥不同的生理作用。本试验饲喂后期，试验组普雷沃氏菌属_1的丰度显著高于对照组，这与刘颖等[42]的研究结果一致。随着日龄的增加，猪饲料中粗纤维含量与肠道中普雷沃氏菌属丰度呈正相关。因此，在动物肠道内普雷沃氏菌属的增加可能会更好的消化分解纤维，促进机体吸收营养物质。

变形菌门中的两个典型致病菌弯曲菌属和脱硫弧菌属，本研究中两组间虽无显著性差异，但试验组整体低于对照组，说明乳酸菌的添加可以抑制肠道致病菌的生长。谢明欣等[43]研究也发现，在绵羊日粮中添加乳酸菌，可提高胃肠道中有益菌数量，降低致病菌数量，这与本试验结果一致。

综上，乳酸菌的添加显著提高了苏尼特羊肠道微生物的多样性和均匀度，以及厚壁菌门、瘤胃菌科_UCG-010、理研菌科RC9肠群和普雷沃氏菌属_1的丰度，从胃肠道菌群角度验证了乳酸菌改善苏尼特羊增重的结果。

4 结 论

饲喂乳酸菌后，苏尼特羊在生长性能方面增重量显著增加；在屠宰性能方面提高了骨肉比和眼肌面积；在肉品质方面，提高了pH24，极显著降低了蒸煮损失；在肠道微生物方面，乳酸菌明显改善了苏尼特羊肠道微生物的结构和多样性，在门水平上，增加了肠道中厚壁菌门的数量，降低了变形菌门的数量，在属水平上，提高了肠道中瘤胃菌科_UCG-010、理研菌科RC9肠群和普雷沃氏菌属_1的丰度。综上所述，日粮添加乳酸菌对提升苏尼特羊生长性能、屠宰性能、改善肠道微生物组成和肉品质具有积极影响，在乳酸菌饲料开发和改善舍饲羊生产性能上具有重要意义。