基于神经肌肉接头兴奋传递研究得气针感调控机制的思路探讨❋

周 晨，刘 群，辛娟娟，赵玉雪，吴 爽，张雯晰，喻晓春，高俊虹

(中国中医科学院针灸研究所，北京 100700)

得气是指针刺入腧穴后气至针下的机体状态，为进一步施加针刺手法的前提条件，亦是判断患者经气强弱、疾病预后的重要依据[1]。针感则是近现代针灸学家提出的生理学概念，它包括针刺过程中医者的主观感觉和患者的自觉反应[2]。针感中包含得气针感和非得气针感(如痛感)。得气针感主要是指医者手下有沉紧感以及患者在针下出现的酸、麻、胀、重感或循经传导的蚁行感[3]。得气针感的形成机制复杂，一直以来都是针灸研究领域的重点工作，但其产生的物质基础至今尚无定论。考虑其作为一种复合感觉，必定有神经系统的参与，而神经广泛分布于穴区各层组织，故得气针感与各个组织层次都有关，是穴区多种组织结构共同作用的结果；另一方面，由于患者的感觉受个体差异、身体部位差异等多种因素的影响，存在一定的主观性和不确定性，故医者手下针感则是对得气判断的主要依据；本研究室前期相关研究提示，医者手下沉紧感可能与肌肉的关系更为密切[4]，因而肌肉组织在得气针感主成分产生的原因中占比重更大一些；而神经肌肉接头作为一类经典的外周胆碱能特化的化学突触，是联系躯体运动神经末梢和骨骼肌的关键部位。因此，有关得气针感与神经、肌肉关系的梳理以及神经肌肉接头兴奋传递调控机制的研究，不但为探讨神经系统突触功能和作用奠定了理论基础，也将为得气针感产生的机制研究提供重要线索。

1 得气针感与穴区神经和肌肉的关系

1.1 得气针感与穴区神经的关系

得气针感与神经的关系十分密切。早在民国时期，以承淡安为代表的针灸学家用西医神经的观点，赋予了“得气”新的内涵即针与神经发生反应，患者也有相应的感觉，“病者亦觉针下酸麻胀重”[5]。20世纪80～90年代，国内生理学家研究已发现90%的穴位都分布着神经束、游离神经末梢和血管神经，如合谷、内关、委中、环跳等要穴多有神经支干通过[6]，尤其是通过八髎穴、背俞穴等与神经血管的解剖关系可知，古人实际已经潜在地循神经取穴[7]。Zhang等学者提出了“神经针刺单元”学说，认为穴位是多种神经末梢装置的复合结构[8]。针刺的感觉信息是由神经传导的，神经是针感产生的必要结构[9]。电生理实验显示，针刺内关或神门，在产生得气感的同时，能记录到肘部及腋部正中神经上出现动作电位[10]。针刺在穴区各种组织中可引起不同的针感反应，但仍以“刺中”神经的发生机会最多。研究表明，深刺足三里、承山、委中等穴位的神经束时容易得气；在针刺后加入手法，加强对腧穴周围神经血管的刺激，可以加速得气的出现[11]。若阻断穴位深部神经及血管神经则针感消失，针效也同时消失[12]。

外周感觉神经纤维是针感产生的物质基础，不同类型的神经纤维被激动会产生不同的得气效应[13]。Wang KM[14]等在研究中发现，针感中的酸感与C纤维关系最密切，麻感主要由Aβ/γ纤维传递，胀、重感由Aδ纤维传导。Beissner[15]等认为，刺痛感主要由Aδ纤维调控，钝、压感则由C纤维参与传递。此外亦有研究显示，毫针直接刺中穴位神经干而产生强烈的“窜、动、抽”针感，可能与髓纤维和H类纤维的传导有关[16]。足够强度的刺激施于穴位方能引起针感。通常手针捻转可兴奋全部Ⅰ-Ⅳ类纤维，以酸胀感为主[17]，电针兴奋A类和C类纤维以麻感为主[18，19]。

1.2 得气针感与穴区肌肉的关系

针刺是一种外力刺激，当刺激达到一定程度时,就会兴奋骨骼肌的深部感受器[20]，通过兴奋性突触，引起肌肉收缩甚至肌肉跳动[21]。肌肉的收缩反应常作为判断得气程度的参考指征。有相关临床实验发现，电针参数恒定，同为足三里穴，得气点的肌缩反应强度明显高于非得气点；且在同等条件下，由于男性相比女性肌肉更加丰厚，男性得气点的电针肌缩反应更强[22]。在临床实践中，针刺飞扬、承山、环跳等肌肉丰厚尤其是靠近肌腹处的穴位，若手法得当常会出现跳动性针感，可获得极好的临床疗效[23]。这种现象是由肌肉突发、快速的收缩所致，是针刺得气的一种表现，所谓“气之至也，如鱼吞钩饵之沉浮”。本研究室前期研究工作观察到，在肌肉丰厚处穴位针刺时，受试者胀感与施针者手下沉紧感常相伴而生，并伴有穴区肌电发放，这提示受试者胀感、酸感及施针者手下沉紧感等得气针感可能主要产生于肌肉组织[4]。

另一方面，相关研究表明肌肉的深部感受器是针感产生的物质基础。众所周知，分布在骨骼肌内的肌梭是一种感受肌纤维伸缩变化的特殊梭形装置，为肌肉丰厚处穴位主要的针感深部感受器[24]。肌梭受到针刺后会收缩、牵拉甚至敏感性增高，处于相对兴奋的状态，同时会发放肌电[25]。临床上发现，通过增加穴位处的肌紧张度再行针刺，可更快速有效地帮助针感产生，这可能与直接刺激到穴区肌梭有关[26]。另有研究监测到，针刺得气时穴位局部有规律的持续性肌电发放，且其幅值、次数与针感强度成正相关[27]。本实验室前期的工作亦提示，施针者手下沉紧感的产生可能是由于针刺使肌肉丰厚处的穴区局部肌肉内的肌梭受压力牵拉等作用而产生形变，引发牵张反射而使穴区局部肌紧张所致[28]。

纵观以上得气针感产生的机制较为复杂，应为穴区多种组织结构共同作用的结果[29-31]，而其中神经和肌肉组织在得气针感主要成分医者手下沉紧感产生机制中的作用可能更加重要。

2 神经肌肉接头兴奋传递调控机制的研究进展

神经肌肉接头(neuromuscular junction，NMJ)是运动神经元轴突末梢在骨骼肌纤维上的接触点，主要由运动神经元、骨骼肌和雪旺氏细胞(Schwann cell)组成[32]。神经元末梢侧的接头膜称为突触前膜，肌细胞侧的接头膜称为突触后膜。前膜乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)囊泡锚定和释放的部位称为活性区，与后膜交叉折叠形成运动终板。后膜有乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor，AChR)以及与其分布一致的乙酰胆碱酯酶(acetylcholin esterase，AChE)高度富集，AChE的作用受肌肉活性和神经诱发胞膜去极化的调节，保证了突触前后膜信息传递的精准高效[33]。当动作电位到达神经末梢时，接头前膜去极化引起电压门控式Ca2+通道开放，细胞外Ca2+进入神经末梢内，促使大量囊泡向前膜靠近并与之融合，囊泡中的ACh以胞裂外排的方式释放入突触间隙，与后膜表面的N2型AChR阳离子通道结合，并使之激活开放，触发肌细胞产生动作电位，引起骨骼肌收缩，随后ACh经AChE水解迅速失活而生理效应终止[34]。在神经肌肉接头的兴奋传递过程中，受到突触前和突触后来源诸多重要信号分子的调控。

2.1 NMJ后膜调控机制研究

一直以来，AChR的簇集被公认为是形成和维持NMJ的标志[35]。目前已知Agrin/LRP4/MuSK信号通路和Neuregulins/ErbB信号通路等介导了的后膜AChR发育、聚集及稳定[36]。

2.1.1 Agrin/LRP4/MuSK信号通路 Agrin/LRP4/MuSK信号通路聚集蛋白(Agrin)是一种由运动神经元胞体合成的分泌蛋白，在运动神经元、肌肉和Schwann细胞中都有表达，具有高度特异性[37]。Agrin与突触后膜受体dystroglycan结合，诱导AChR聚集、重排，不仅在促进NMJ形成的过程中起着关键作用，对NMJ的稳定和修复也非常重要[38]。肌肉特异性激酶(muscle-specific kinase，MuSK)是一种跨膜蛋白，通过发育的骨骼肌细胞选择性表达并聚集在突触后膜，对于NMJ组织结构和功能的完整必不可少[39]。MuSK作为Agrin受体，在Agrin信号传导调控中发挥着关键作用。Jones实验证明，虽然肌纤维具有表达足够水平AChR的潜能，但只有MuSK蛋白经Agrin快速磷酸化激活后才会启动细胞内信号级联反应，诱导AChR的聚集，这一过程受正反馈调节[40]。尽管Agrin和MuSK是调控AChR簇集信号通路中的关键性物质，但两者间并不能直接相互作用[41]。而骨骼肌源性低密度脂蛋白受体相关蛋白4(Low-density lipoprotein receptor-related protein 4，LRP4)作为共受体介导Agrin对MuSK的激活作用，诱导突触后膜AChR聚集簇形成[42]，还能逆向调控运动神经元轴突末梢的分化[43，44]。此外Choi等研究表明，LRP4还通过与淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)相结合形成复合物，显著增强agrin诱导AChR聚集[45]。

2.1.2 Neuregulins/ErbB信号通路 在NMJ发育过程中，神经调节蛋白家族成员Neuregulin1(Nrg1)其酪氨酸激酶受体ErbB广泛表达于运动神经元、骨骼肌纤维及Schwann细胞中[46]。Nrg1参与NMJ后膜特异性基因的表达，Simeone和Straubinger实验报道敲除小鼠Nrg1，突触后AChR密度降低50%，Nrg1与ErbB受体的相互作用通过细胞内分子erbin，促进MuSK磷酸化[47]。Schmidt认为，Nrg1与受体ErbB的相互作用通过α-dystrobrevin磷酸化稳定突触后装置，从而有助于将AChR簇锚定在突触后膜上[48]。Nrg1-III不仅是Schwann细胞识别并包绕轴突形成髓鞘的关键因素，还调控髓鞘厚度[49]。在Nrg1-III敲除体中，未成熟Schwann细胞的形成数量明显减少[50]。由于Schwann细胞也表达Nrg1及其受体，越来越多研究提示，Nrg1对NMJ突触后膜的调节作用可能通过调控Schwann细胞的存活及其功能间接实现[51]。Lee等[52]研究亦发现，运动神经末梢特异性过表达Nrg1转基因小鼠显示出明显的NMJ突触“消减”加速表型，成年后持续过表达Nrg1则促进NMJ结构与功能重塑，表明运动神经源性Nrg1对NMJ可塑性的调控作用可能依赖于运动神经末梢Schwann细胞的功能发挥。

2.2 NMJ前膜调控机制研究

NMJ突触前运动神经末梢的分化与成熟依赖于骨骼肌来源“逆向”信号分子的调控作用，较之于运动神经来源“顺向”信号研究，目前对“逆向”信号分子研究较为有限，主要集中在β-连环蛋白(β-catenin)、层黏连蛋白β2(laminin β2)、β1整合素(β1 integrin)等相关信号分子调控方面[53]。

2.2.1 Wnt/β-catenin信号通路研究发现，Wnt信号通路在突触发育过程中起着决定性作用，Wnt配体蛋白为突触生成因子[54]。蓬乱蛋白(dishevelled protein，Dvl)作为Wnt信号通路的中心效应因子，能够与MuSK相互作用，调节AChR聚集[55]，若Dvl突变则会引起体外培养NMJ突触前后膜的功能异常。Wnt家族中Wnt3a可通过抑制NMJ脚手架蛋白rapsyn转录，减少AChR聚集簇形成[56]。Li等[57]通过采用骨骼肌特异性敲除β-catenin，可导致小鼠出生后即刻死亡，并伴有严重的NMJ发育缺陷，如运动神经轴突功能异常、膈神经自发放电频率显著降低，而当运动神经元特异性敲除β-catenin后，突变小鼠NMJ形态和功能不受影响。首次在基因水平证实，Wnt下游信号分子β-catenin直接参与NMJ“逆向”信号通路的调控。

2.2.2 laminin β2/β1 integrin信号通路 laminin β2除了与P/Q钙通道结合外，还激活细胞外基质蛋白ECM受体β1 integrin，在缺乏集聚蛋白的情况下增加AChR聚集，提示这一机制参与神经AChR簇“预排”的形成。然而在缺乏β1 integrin的小鼠中，肌细胞在Agrin的作用下形成AChR簇，表明laminin β2/β1 integrin通路对NMJ发育的调控作用可能还存在一些非AChR转录依赖的其他途径[58]。Lluri等[59]研究发现，TIMP-2敲除小鼠的肌肉组织中β1 integrin表达水平显著下降，同时伴有运动神经元轴突过度分支和突触消减障碍的表型，这与骨骼肌特异性β1 integrin敲除小鼠具有一定的相似性，验证了β1 integrin可作为“逆向”信号分子参与调控突触前运动神经元的发育和成熟。Fox等[60]进一步通过基因敲除手段得到的laminin β2突变小鼠，表现出严重的NMJ突触前发育缺陷，证实了骨骼肌来源多种“逆向”信号分子可相互协同共同调控NMJ突触前膜特化结构的形成、成熟和功能维持。

2.3 Schwann细胞在NMJ调控中的作用

Schwann细胞包绕在运动神经轴突终末，在NMJ的发育和终板的维持中起积极作用[61]。在发育过程中，轴突终末随Schwann细胞延伸，并向肌肉-神经接触之前的NMJ附近迁移[62]。体内实验证明，Schwann细胞在突触生长期前数量增多，在轴突生长和神经支配过程中起引导作用[63]。相反，缺乏Schwann细胞会诱导发育中的NMJ突触前和突触后缺陷[64]。

Schwann细胞会分泌Agrin、Tgf-β1和CNTF、BDNF、MMPs等神经营养因子，促进AChR聚集，提高发育突触的递质传输效率，可支持肌肉-神经接触。反过来，Schwann细胞受肌肉衍生因子如NT-3、Nrg1或神经元释放因子如ATP、Ach和Agrin的影响[65]。Fields研究表明，小鼠在高频神经刺激下，ACh从神经末梢释放期间会引起Schwann细胞中的Ca2+应答[66]。Trachtenberg实验室观察到，新生大鼠NMJ去神经支配后，局部注射Nrg1就能阻止Schwann细胞退变[67]。

3 神经肌肉接头兴奋传递在得气针感中调控机制的新思路

由上可知，有关得气针感与肌肉、神经的关系以及NMJ结构、功能和信号机制方面的研究由来已久。亦有许多相关研究表明，针刺能够通过调节NMJ分子，促进NMJ重建再生。Huang等研究表明，针刺能增加AChR的表达，促进受损骨骼肌合成更多Agrin，正向调控MuSK蛋白的表达水平，加强AChR的募集，促进骨骼肌功能的恢复[68，69，70]。徐前威[71]报道，电针能通过增加AChE和AChR表达，促进大量新生肌纤维生成，有利于受损骨骼肌运动终板的修复。徐家淳[72]在离体研究中发现，火针干预能调控脊髓损伤神经干细胞Wnt 3a、β-catenin基因的表达。赵硕[73]认为，针刺促进坐骨神经损伤大鼠神经纤维修复的机制，与上调脊神经节中NCAM和CNTF的表达有关。黄志强[74]检测到，电针能提高急性损伤脊髓中NGF、BDNF的表达。陈怡然[75]等发现，针刺治疗能加快神经组织中Schwann细胞增殖，促进髓鞘重建和轴突再生，上述研究成果为NMJ信号分子在针刺调控中的作用提供了重要线索，然而NMJ在穴区不同组织结构得气针感中扮演的角色犹未可知。

如前所述，得气针感作为一种复合感觉，必定有神经系统的参与；另一方面，肌肉组织在得气针感主要成分产生的原因中占比重更大一些；作为运动神经末端和肌肉相连接的最重要的部位，NMJ是引发肌肉收缩的关键部位，其各个层面的调控作用与得气针感产生的机制密不可分。综上所述，以运动神经元轴突末梢和肌纤维相连接的效应位点NMJ为切入点，观察穴区组织神经元及其神经纤维投射的分布规律以及针刺得气前后NMJ相关的组织形态学变化情况，并结合针刺得气前后穴区局部组织中NMJ前膜和后膜的相关信号站点的调控变化，详细分析上述参与NMJ调控各层面的信号分子中哪一个或哪一些成分在介导得气针感中发挥作用，探讨其兴奋传递在得气针感产生过程中的调控机制，将为指导临床实践提供全新的视角和思路。