异地制作保山猪冷冻精液技术

高玉琼 李春平 龚绍荣 赵家才 朱新培*

1.云南农业职业技术学院，昆明650212；2.云南省保山市保山猪繁育中心，云南保山678200

保山猪曾用名为保山大耳猪，是“云南六大名猪”之一，近年来因受各种因素的影响，饲养比例和饲养总数在急剧下降，根据国家遗传资源调查濒危程度标准界定：保山猪已处于濒危——维持状态。1999年开始，由保山市保山猪繁育中心对保山猪进行保种，但是活体保存需要投入大量的人力、物力和财力，再加上近年来疫情的威胁，活体保存存在一定的风险。猪冷冻精液作为活体保护的补充方式，不仅可以长期保存其遗传物质，实现地方猪遗传物质的静态保存，为维持生物多样性提供条件，还可以通过优质种公猪精液的交流来建立和增强场间遗传联系和跨群联系，克服远程输精的困难，最大限度地利用种公猪遗传物质。但猪精子对温度的变化敏感，国内猪精液冷冻损伤的机理研究不足，冷冻保护剂的开发、冷冻技术、程序设计等环节还比较薄弱，猪冻精的生产还不成熟。本试验的保山猪精液来源是位于保山市施甸县的保山猪种猪场，因当地不具备制作冷冻细管冻精的条件，所以要将鲜精运输至昆明小哨的云南省家畜冷冻精液站进行制作，猪新鲜精液活力具有时效性，地方品种又具有一定的地域性，因此异地制作保山猪冷冻精液是本试验的难点。

1 材料与方法

1.1 准备工作

1）工作人员的准备。工作人员应着干净利落的工作服，指甲剪短磨平，洗净双手、擦干，带上双层手套，内层为聚乙烯手套，外层可戴一次性薄膜手套，以免精液的污染和人畜共患病的传播。

2）公猪的准备。选择系谱清楚，记录完整，本品种特征突出明显的优秀公猪用于采精，提前对种公猪进行调教驯化，以便人工进行采精。采精时，将公猪赶至采精栏内，挤出公猪包皮内的尿液，先用温水冲洗掉包皮周围的污物，再用温的0.1%高锰酸钾溶液清洗腹部和包皮，然后再用温水冲洗一遍，之后用毛巾擦干。

3）器械的准备。工作人员将集精袋放进集精杯中，将袋口打开，环套在杯口边缘，然后将精液过滤膜罩在杯口，用橡皮筋固定住，放在35 ℃的恒温箱中预热备用。为避免污染，集精袋和滤膜每头猪换一个，其他的玻璃器皿、器具也要进行高温消毒，塑料器具用75%的酒精消毒或紫外线消毒。

1.2 采 精

保山种猪场在繁殖过程中多采用本交，因此人工采精难度大，调教时间和过程较长，一般采用手握法采精[1]。采精前，取一些母猪阴道分泌物涂抹在假台畜尾部，以刺激其性欲。采精时，采精人员站在猪的左侧，当公猪爬跨假台猪，并伸出阴茎龟头来回抽动，说明公猪性欲已经旺盛，待公猪伸出阴茎龟头时，采精员用手握紧伸出的龟头，当公猪前冲时顺势将阴茎的“S”状弯曲拉直，握紧阴茎，同时不断挤压。射精过程不可松手、力度适中、尽可能使阴茎与地面保持水平。开始射精时射出的清亮液体部分应弃之，射出白色液体时开始收集。在保山猪采精过程中，经常出现采精人员触摸到公猪龟头或阴茎时，公猪阴茎便缩回的情况。遇到这种情况，不可强拉或敲打，应再次耐心引导，直至采精成功。采精结束后，先将滤膜及其上面部分丢弃，再将杯口外的集精袋撕去，盖上盖子，送入精液处理室进行处理。

1.3 鲜精的检查和处理

鲜精的质量不仅可以反映公猪的饲养管理水平和身体机能状况，也能反映出采精人员的技能水平，更重要的是，在保山猪冷冻保存过程中，鲜精的质量直接决定着冻后的精液质量。鲜精的检查主要鉴定鲜精的质量，以判断是否具有进行冷冻保存的实际意义。

1）鲜精的颜色和气味。鲜精的颜色一般为乳白色，略带腥味。精液中有时会有白色或灰白色絮状物，一般可通过过滤去除。当精液颜色异常或带有特殊臭味时，不宜留用。

2）精液量。为了避免精液转移引起精子损伤，用电子秤按1 mL=1.0 g 计算其采精量[2]。

3）活力。取10 μL 精液置于载玻片上，盖上盖玻片，在400 倍显微镜下观察直线运动精子数占总精子数的比列，至少观察3 个视野，取平均值，鲜精活率需达65%以上方可用于制作冻精。

4）密度。采用精子密度仪进行密度测量，一般按照相应的操作规程即可。

5）精液的预处理。提前将原精稀释液放置于35 ℃的水浴锅中备用，待鲜精检查合格后，按1∶1比列将原精稀释液缓缓沿杯壁导入精液中。如果原精密度较高，可将原精稀释液分2 次加入。稀释好的精液先在室温条件下放置1 h，然后再放入17 ℃的冰箱平衡2 h。

1.4 运 输

本试验中精液从保山市保山猪繁育中心送至客运站，通过大巴车运送到昆明西站，再从西站运至冷冻精液站进行制作，运输过程长达12 h 以上。运输前，准备好一个泡沫箱，在泡沫箱中放置适量的冰袋，盖上盖子静置30 min，维持箱内温度恒定于12～17 ℃。然后将精液分装在猪精液输精瓶中，为避免运输中摇晃震动带来的精子损伤，尽量将输精瓶装满，然后将输精瓶装入黑色塑料袋中扎紧，避免摇晃。每头猪的精液分装在一个塑料袋中，并做好标记，放置在泡沫箱中，盖上盖子，用胶布密封好。冰袋和精液需用干净纸或者毛巾隔开，避免直接接触冰袋[2]。

1.5 精液二次检查

精液运至冷冻精液站后应及时进行处理，进行第二次精液质量的检查，主要是测量精液量、密度和活力。计算精液量时用每瓶输精瓶的精液量乘以数量即可，密度和活力的检查方法和原精一致，并做好记录，活力低于60%的不再留用。

1.6 离 心

经测量后达到要求的精液倒入50 mL 的离心管中，放置于离心机中以3 000 r/min 的转速离心10 min。然后倒去上清液，并测量上清液的密度和体积，如果上清液中总精子数多于10 亿，需再次离心。

1.7 第二、三次稀释和细管冻精制作

根据密度再进行2 次稀释，所用稀释液为Ⅰ和Ⅱ液，本试验选取5 个稀释液配方，分别编号1、2、3、4、5，Ⅰ液中不含甘油，Ⅱ液中含甘油，其他成分相同。为了筛选适宜的活性剂，试验选取一个稀释液配方，在该配方中加入Equex 膏(氨基钠-十二烷硫酸脂)、OEP、十二烷基磺酸钠（SDS）3 种不同的活性剂，最后根据试验数据进行分析。稀释时Ⅰ、Ⅱ液的加入量相同，均为总稀释量的一半。总稀释量=（密度×精液量-上清液中精子数）/目标密度，本试验中目标总精子数为6 亿/mL。稀释时将Ⅰ液缓慢分加到离心沉淀后的离心瓶中，用一次性滴管以不断吸吐的方式混悬精子，然后几个离心瓶中的精液合并，在用Ⅰ液冲洗，再合并，并做好标记。将标记好的精液放入4 ℃的冰箱中平衡3～4 h，然后用4 ℃Ⅱ液进行第三次稀释，稀释方法和稀释液的数量和第二次稀释相同，稀释后摇匀。然后4 ℃的环境条件下用细管分装机进行细管分装，并在细管上标记制作日期、猪的品种、耳号等信息。将分装好的细管平铺在细管架上，再将细管架置于盛有液氮的液氮槽中，液氮槽中液氮的高度不能太低，细管距离液氮面3～5 cm，盖上盖子冷冻13 min。冷冻后再进行1 次活力的检测，检测前取1 支细管冻精在37 ℃的水浴锅中进行解冻，然后在400 倍的显微镜下进行观察检验活力，方法同上，活力低于30%者不能保存，其他的做好标记装袋浸入液氮中进行保存。

2 结果与分析

2.1 采精情况

保山猪以本交为主，人工采精比较困难，需要用发情母猪诱导刺激才能采集到精液，采精环境要求安静，固定采精员，采精技术娴熟才能顺利采到精液。

2.2 保山猪的精液品质

1）保山猪原精液品质。保山猪精液品质良好，保山猪采精量为（215.69±66.40）mL，原精活力（64.68±5.57）%，精子密度（1.23±0.62）亿/mL，8 个家系9 头不同个体精液品质详见表1。

表1 不同个体保山猪精液品质指标比较[3]

2）保山猪冷冻精液品质。保山猪细管冻精解冻活力均在30%以上，符合全国畜牧总站畜禽遗传资源保存利用中心的要求，平均解冻活力为（34.92±4.59）%，解冻后精子顶体完整率为（48.27±8.11）%，畸形率为（9.07±5.12）%。

3）不同冷冻稀释液的效果。本试验选取5 种不同稀释液配方，经分析，不同稀释液配方对原精活力、解冻活力、正常顶体率、精子畸形率的影响差异不显著（表2）。

表2 不同稀释液对保山猪精液冷冻效果的比较 %

3 讨 论

猪精液对温度变化敏感，运输距离远，精液保存时间较长，实施异地制作和冷冻保存，公猪精液采集后必须尽快用营养液稀释并在17 ℃恒温保存，做好精液的保温隔热，猪精液不能与冷源直接接触，每份精液间要相对隔开，不能堆挤，避免激烈震动和温度变化，猪精液送达后及时加工制作。

3.1 异地制作保山猪冷冻精液切实可行

通过本研究结果得出，公猪采精后用营养稀释液稀释、17 ℃恒温保存、运输、24 h 内异地制作保山猪冻精，冻精质量良好，解冻活力30%以上，符合保存使用要求，为地方优良品种遗传物质保存提供可靠技术和便捷途径。

3.2 筛选出效果良好的冷冻稀释液

种公猪精液常（低）温保存技术已经比较成熟，稀释液是影响冷冻效果的重要因素[4]，专用稀释剂保存效果良好，在17 ℃恒温下可保存1～7 d；该项目研究得出1 号和4 号配方冷冻解冻活力和顶体完整率均高于2 号、3 号和5 号配方，1 号和4 号配方冷冻解冻活力和顶体完整率达到进口稀释液的效果，可大幅节约冻精制作成本。

3.3 优选获得效果较好的活性剂

试验得出：活性剂Equex 膏（氨基钠-十二烷硫酸脂）的效果好于OEP 和十二烷基磺酸钠（SDS），SDS 使用效果较差，但差异不明显。

保山猪冷冻精液异地制作技术可作为活体保种的有效补充方式，不仅可以长期保存其遗传物质，实现地方猪遗传物质的长期安全保存，为维持生物多样性提供条件，而且还可以通过优质种公猪精液的交流来建立和增强场间遗传交流和跨群联系，防止疾病传播和疫病危害，克服活体远程运输的困难，最大限度地保护和利用优良种公猪遗传品质。