基于三苯胺的粘度荧光探针的构建及性质研究*

黄 娜，杜海灵，陈 曦，沈舒婷，王 慧，胡 磊

(皖南医学院药学院，安徽 芜湖 241002)

小分子荧光探针因其具有高的灵敏度、快的反应速度、好的稳定性、强的特异性、操作简便和结构易修饰等特点，已经被广泛用于化学传感、生物医药、生物传感、生物成像等领域[1-3]。近几十年来，科研工作者们也设计合成了许多小分子荧光探针用于检测生物体内的生物分子(如金属离子、活性氧等)和细胞内的微环境(如粘度、极性、pH、温度等)[4-6]。在诸多被检测物中，粘度，作为细胞内微环境的一个重要参数，在物质运输、生物分子相互作用等过程中起着至关重要的作用[7-8]。细胞粘度水平的异常，也与多种疾病密切相关，如脑血栓、动脉硬化、阿尔兹海默症、恶性肿瘤等[9-10]。因此，开发专一性响应细胞内粘度的小分子荧光探针具有重要的科学意义。

三苯胺及其衍生物因具有较高的给电子性、较高的空穴迁移率、较低的离子化电位和较强的荧光性能与光稳定性等已被广泛应用于光电材料等领域[11-12]。本文以三苯胺为母体，通过缩合反应等设计合成了一种荧光粘度探针L(图1)，在分子中引入磺酸盐以提高分子的生物相容性。研究了探针L的荧光强度随粘度的变化测试，结果显示随着粘度的增加，探针L的荧光强度显著增强，并将其应用于细胞成像。

图1 探针L的合成路线图Fig.1 The synthetic route of probe L

1 实 验

1.1 仪器与试剂

仪器：Bruker Avance 400型核磁共振仪(TMS为内标)，德国布鲁克；UV-5900PC型紫外光谱仪，上海元析；HITACHI F-4600型荧光光谱仪，日本日立；Infinite 200 pro型酶标仪，瑞士Tecan；Leica TCS SP 8 型共聚焦显微成像系统，德国徕卡；Nicolet FT-IR-is5型傅里叶变换红外光谱仪(KBr压片)，美国赛默飞；Finnigan LCQ 型质谱仪(ESI源)，美国赛默飞。

试剂：碘苯(98%)，3-甲氧基苯胺(98%)，碘化亚铜(98%)，叔丁醇钾(98%)，1,10-菲啰啉(99%)，三溴化硼(99.9%)，2-甲基苯并噻唑(98%)，1,3-丙磺酸内酯(99%)，其它试剂和药品均为分析纯，上海阿拉丁试剂有限公司；三氯氧磷(99.5%),安耐吉化学有限公司；实验用水为超纯水。

1.2 探针L的合成

中间体M1和M2的合成见参考文献[13-14]。在100 mL圆底烧瓶中依次加入M1(0.28 g，1 mmol)、M2(0.27 g，1 mmol)、乙醇(40 mL)和哌啶(100 μL)，回流反应20 h后，减压除去大部分溶剂，粗产物经硅胶柱层析分离(洗脱剂为二氯甲烷∶甲醇=50∶1)，得纯紫红色固体。产率：52%。1H NMR (600 MHz, d6-DMSO) δ: 10.74 (s, 1 H), 8.29～8.23 (m, 2 H), 8.19 (d,J=15.4 Hz, 1 H), 8.02 (d,J=9.0 Hz, 1 H), 7.85 (d,J=15.4 Hz, 1 H), 7.79 (t,J=7.9 Hz, 1 H), 7.69 (t,J=7.8 Hz, 1 H), 7.46 (t,J=7.9 Hz, 4 H), 7.30～7.23 (m, 6 H), 6.34 (m, 2 H), 4.96～4.90 (m, 2 H), 2.62 (t,J=6.4 Hz, 2 H), 2.18～2.12 (m, 2 H). IR (selected bands, cm-1): 3481, 1612, 1571, 1483, 1442, 1382, 1326, 1265, 1232, 1193, 1151, 1115, 1043, 959, 757, 705. ESI-MS: 理论值：542.1334；实验值：543.1403 [M+1]+。

2 结果与讨论

2.1 探针L对粘度的响应性质

首先测试了探针L在PBS缓冲溶液和99%甘油中的紫外可见吸收光谱，如图2A所示，探针L在PBS缓冲液中紫外的最大吸收峰位于508 nm左右，而在99%的甘油中紫外的最大吸收峰位于540 nm左右，发生了明显的红移，造成这一现象的可能原因是在高粘度的溶剂中，分子的扭转受限。初步判断探针L可用于粘度测试。

紧接着，研究了探针L在水和甘油不同体积比溶液中的荧光发射性质。如图2B所示，在514 nm的激发波长下(狭缝宽度均为10 nm，电压为500 V)，探针L在620 nm处的荧光强度值随着甘油体积比的增加而逐渐增强。从低粘度的PBS溶液到高粘度的甘油溶液中，整个混合溶液的体系粘度数值从1.03 cp增大至956.00 cp，同时探针L的荧光强度也增强了283倍左右，这种现象可解释为在低粘度的溶液中，分子中与烯烃双键相连的单键可以自由旋转，分子内的能量主要以非辐射跃迁方式衰减，当体系粘度增加时，单键的自由旋转受到限制，这种跃迁方式被削弱，从而导致荧光增强[15]。根据福特斯-霍夫曼方程[16]对探针L在620 nm处荧光强度的对数与粘度对数之间进行了线性拟合，如图2C所示，从图中可以看出，探针L的荧光强度比值(logI)与粘度对数(log(viscosity))之间的线性相关性为0.9923，线性回归方程为logI=0.82 log(viscosity)+1.62，因此，我们可以利用此方程先测得待测溶液的荧光强度数值，将数据带入方程，即可求得待测溶液的粘度数值。由于探针L的最大发射峰属于红光发射区域(λem=620 nm)，可消除细胞内蓝绿区自发荧光的干扰，提高信噪比，有望用于生物体系测试。

图2 探针L在PBS和99%甘油中的紫外可见吸收光谱图(A)；探针L在PBS和甘油不同体积分数的溶液中的荧光发射光谱 (λex=514 nm)(B)；探针L荧光强度的对数与溶剂粘度对数之间的线性关系(C)；探针L在不同分析物中的荧光强度之比(D)Fig.2 UV-vis absorption spectra of probeL in PBS and 99% glycerol, respectively(A); Fluorescence spectra of L in solutions with different volume fractions of PBS and glycerol(λex=514 nm)(B); Linear relationship between logI and logviscosity(C); Ration of fluorescence intensity of probe L in different analytes(D)

在进行生物测试之前，探索了细胞内的多种物质(如活性氧、氨基酸、生物大分子)对探针L荧光强度的影响。实验结果见图2D，探针L只有在99%的甘油体系中荧光强度最强，而其他分析物的加入基本不会影响探针的荧光强度，说明探针L在复杂的生物体系中表现处对粘度的专一性。

2.2 细胞毒性与成像实验

细胞毒性测试可检测探针对细胞的毒性大小，只有具有较低细胞毒性的探针才可以安全地用于细胞成像中。采用MTT方法对探针L的细胞存活率进行了测试，以人肝癌细胞(HepG2)为模型，将不同浓度的探针与HepG2细胞共培养24 h，按照文献的方法处理后[17]，测试了在490 nm处各个孔的吸光度值，根据公式计算得出细胞的存活率，如图3所示，当探针L的浓度达到25 μM时，细胞存活率仍在80%以上，说明探针L具有较低的细胞毒性，可用于细胞成像中。

图3 探针L与HepG2细胞共同孵育24 h后的细胞毒性测试Fig.3 Cytotoxicity test of probeL incubated with HepG2 cells for 24 h

在细胞成像实验中，设计如下两组实验：一组是将浓度为10 μM的探针L与HepG2细胞共培养30 min后，用PBS洗涤两遍；另一组是先用制霉菌素(nystatin)处理细胞1 h，然后加入探针L溶液继续与细胞共培养30 min，用PBS洗涤两遍，用激光共聚焦显微镜进行观察，实验结果如图4所示，细胞未用制霉菌素处理前，探针L在HepG2细胞中仅显示处微弱的荧光，但用制霉菌素处理细胞后，探针L在细胞内的荧光强度增强，是由于制霉菌素可诱导细胞结构发生变化或肿胀，导致细胞内粘度增加[18]。以上结果表明探针L可作为粘度探针用于细胞成像。

图4 探针L在对细胞用制霉菌素处理前后的细胞 显影图(标尺20 μm)Fig.4 Fluorescence images of HepG2 cells incubated with probeL before and after treatment with nystatin(Bar=20 μm)

进一步探索了探针L在生物组织成像中的应用，选取小鼠的大脑组织作为模型，冷冻切片成厚度为20 μm的切片。向大脑组织中加入PBS溶液培养，然后探针L(10 μM)溶液，在37 ℃恒温培养箱中培养30 min，用PBS洗涤3遍后，将组织固定在载玻片上，直接用于共聚焦成像测试。如图5所示，探针L能够很好的着色小鼠的大脑组织，且渗透深度达到15.96 μm，说明探针L有较好的组织穿透力，可用于组织成像。

图5 探针L与小鼠大脑组织共培养后的组织成像图(A)； 小鼠大脑组织的渗透深度图(B)(标尺为100 μm)Fig.5 Cofocal images of a mouse brain tissue incubated withL(A); The depth of tissue penetration (B)(Bar=100 μm)

3 结 论

以三苯胺为母体，设计合成了一种新型的粘度荧光探针L，系统研究了探针L对粘度的响应性质及其他分析物的干扰性质，结果表明，随着粘度的增加，探针L在620 nm处的荧光强度增强约283倍，且不受生物体内其他分析物的干扰。生物实验结果表明，探针L具有较高的细胞存活率，可用于检测用制霉菌素处理细胞后的粘度变化；在组织成像中，探针L表现出较深的组织渗透能力。该研究结果为后期设计具有较好生物相容性的粘度荧光探针提高了实验基础。