呼吸道合胞病毒感染动物模型的构建与评价

齐莉莉刘宏李剑

(1.河北医科大学教学实验中心,石家庄 050017;2.河北医科大学第二医院,石家庄 050000;3.河北医科大学基础医学院,石家庄 050017)

人类呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,hRSV)是儿童下呼吸道感染(lower respiratory tract infection,LRTI)最常见原因之一,每年致全球270 万 ～ 380 万儿童住院,94 600 ～149 400 名5 岁以下儿童死亡[1]。 尽管病毒抗原变异较少,但由hRSV 诱导的免疫持续时间很短,所以会在整个生命周期内反复感染[2]。 hRSV 疫苗开发的障碍主要有:自然感染未能防止再感染、接种福尔马林灭活的hRSV 疫苗(formalin-inactivated,FIhRSV)会使幼儿病情加重[3],以及缺乏能完全重现hRSV 感染发病机制的动物模型等。 由于难以在临床前研究中可靠的证明其安全性和有效性,所以疫苗的开发受到重重阻碍。

除黑猩猩外,其他非人类灵长类动物仅对hRSV 复制呈半容许水平,大剂量病毒的实验性感染只导致轻微的肺部病变。 其他动物模型,如棉鼠、小鼠、雪貂和羔羊,也只能半容许hRSV 复制。尽管如此,棉鼠和小鼠对于开发单克隆抗体,预防高危婴儿感染hRSV 具有重要价值,并为深入了解hRSV 的发病机制提供了方向[4]。

对非人类肺炎病毒在其自然宿主中的研究,例如感染牛呼吸道合胞病毒(bovine respiratory syncytial virus,bRSV)的犊牛模型和感染鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice,PVM)的小鼠模型[5-6],它们不仅在探讨肺炎病毒感染的发病机制中具有价值,而且还被用于评估hRSV 疫苗的效果。

1 人类感染hRSV 的特点

hRSV 主要经空气飞沫或直接接触传播。 最初病毒复制发生在鼻咽,潜伏期4 ～ 5 d,随后可传播到下呼吸道。 人感染hRSV 的临床表现可以从普通感冒到毛细支气管炎,婴儿会出现气道阻塞、缺氧、哮喘和肺炎,1% ～ 24%的婴儿会有呼吸暂停[7]。hRSV 主要在纤毛气道上皮细胞及I 型和II 型肺泡细胞中复制。 感染hRSV 重症患者的肺组织病理学变化以细支气管周围和血管周围单核细胞积聚、间质性肺炎、细支气管上皮细胞坏死脱落、巨噬细胞、中性粒细胞、纤维蛋白和粘蛋白阻塞细支气管腔为特征[8]。 毛细支气管炎患儿的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage,BAL)中以中性粒细胞为主,气道分泌物中含有高水平的促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1α(IL-1α)、CXC/CC 趋化因子(如IL-8、MIP-1α、MCP-1 和RANTES),及干扰素(IFN)、IL-4、IL-5、IL-10、IL-9 和IL-17[9],表明强烈的炎症反应有助于推进hRSV 致病过程。 而不同病毒株本身的特性也可能导致疾病严重程度的变化[10]。

2 呼吸道合胞病毒感染的动物模型

hRSV 的动物模型包括使用hRSV 感染非人类哺乳动物的模型,以及在自然宿主中研究非人类肺病毒的模型。 主要使用的非人类哺乳动物有非人灵长类动物、棉鼠、小鼠和羔羊。 除了黑猩猩之外,这些动物对hRSV 的复制都是半允许的,所以在实验中大剂量病毒感染仅会导致很少甚至无临床症状。 相反,非人类肺病毒的自然宿主对病毒的复制和感染致病是完全允许的。

2.1 非人灵长类动物(non-human primates,NHP)

2.1.1 黑猩猩

hRSV 最初是从20 只圈养黑猩猩中分离出来的[11],人们后来发现这种病毒不仅能在黑猩猩之间传播,还能从黑猩猩传播给人。 实验室感染104pfu hRSV 的黑猩猩可以排出大量病毒(鼻咽拭子样本和BAL 分别为105和106pfu/mL)并持续6 ～ 10 d,这与在儿童身上看到的情况一致[12]。 尽管在实验中感染的黑猩猩未出现下呼吸道感染症状,但在动物园圈养的黑猩猩和科特迪瓦一个研究站饲养的黑猩猩身上已经报告了hRSV 相关支气管肺炎的重症病例,其中一些还合并肺炎链球菌感染[13-14]。 广泛支气管肺炎和间质性肺炎的组织病理学样本中可以检测到hRSV 抗原,偶尔出现的合胞体细胞与人类婴儿的病变相似[13]。 肺炎链球菌已经被证明在体外和棉鼠中都能加重气道上皮细胞中hRSV 的感染[15]。

黑猩猩已经被用来评估hRSV 减毒活疫苗的毒力和保护效力[16]。 减毒hRSV 在黑猩猩体内的复制和遗传稳定性与血清阴性的儿童相似,而且减毒株能够诱导黑猩猩抵抗随后的野生型hRSV 攻击[17]。 然而,接种表达hRSV 表面糖蛋白F 和G 的重组痘苗病毒(rVV)的黑猩猩只产生了低水平的中和抗体,而且对抵抗hRSV 攻击的保护力很差。 这些现象与相同的rVV 对小鼠、棉鼠和猫头鹰猴几乎完全的保护效力形成了鲜明对比[18]。

2.1.2 非洲绿猴

为了评估hRSV 候选疫苗,许多研究选用了半允许hRSV 复制的非洲绿猴(African green monkeys,AGMs)[19]。 hRSV 感染后,AGMs 仅在肺部出现轻微的组织病理学改变,临床症状不明显[20]。 感染hRSV 孟菲斯M37 株的猴子BAL 中的中性粒细胞比例仅增加到9%[21],而中性粒细胞却是hRSV 感染儿童BAL 中的主要细胞[22]。

Kakuk 等[23]发现,接种FI-hRSV 的AGMs 被hRSV 感染后,会出现疫苗增强的肺部病理改变。接种了福尔马林灭活的单纯疱疹病毒(FI-HSV)的AGMs,如若感染hRSV 也会出现增强的组织病理学变化,只是其严重程度低于接种FI-hRSV 的动物。这些现象表明,对疫苗中存在的细胞培养成分的免疫反应和hRSV 刺激,可能是FI-hRSV 接种动物出现增强的病理学改变的原因。

虽然一些hRSV 疫苗已被证明可诱导小鼠或棉鼠对hRSV 产生完全的保护作用,但Eyles 等[21]用这些疫苗免疫AGMs,发现其保护效力并不相同。只有在用表达F 或G 蛋白的复制缺陷型重组腺病毒(rAdV)初次免疫、纯化的hRSV F 和G 蛋白加强接种后,上、下呼吸道才能获得完全保护。 以氢氧化铝和CpG 为佐剂的F/G 蛋白会使病毒复制显著减少。 然而,在接种疫苗的猴子中,没有任何证据表明肺部炎症增强。 这些观察结果表明,小动物模型无法预测hRSV 疫苗在AGMs 中的效力。

2.1.3 其他NHP

尽管对hRSV 半允许复制,许多NHP 已被用作hRSV 的感染模型。 感染hRSV 的猫头鹰猴会出现鼻炎,其症状轻于黑猩猩,病毒能够在鼻咽中有效复制8 ～ 17 d[24]。 猫头鹰猴对hRSV 减毒活疫苗的反应与黑猩猩相似,治疗性地给予含有病毒中和抗体的人IgG 可以显著降低肺病毒载量,但肺病理损伤未见改善[25]。

经气管接种大剂量hRSV(107.9pfu)的幼狒狒会出现LRTI[26],BAL 中的病毒滴度在接种后24 h达到最大值,随后下降。 肺部显示血管充血和水肿,镜下特征为间质性肺炎、细支气管上皮脱落、细支气管管腔阻塞和炎性细胞浸润。 病毒抗原主要分布于肺实质,少量散在分布于肺上皮细胞。 感染后24 h BAL 的中性粒细胞迅速增加,第3 天开始下降,随后巨噬细胞数量上升。 人们需要进一步的研究,以确定肺部炎症反应是病毒复制的结果,还是对高剂量接种物的非特异性炎症反应。

2.2 绵羊

hRSV A2 感染新生羔羊后,会引起轻微发热和咳嗽,肺部主要病理特征是肉眼可见的多灶实变,以及与hRSV 感染儿童相似的显微镜下病变[27]。在纤毛支气管上皮细胞和合胞体细胞中可以检测到病毒抗原。 感染后第3 ～ 6 天,BAL 中的病毒mRNA 从较低水平增加到峰值,并在第14 天消退。感染高剂量hRSV M37 的羔羊会出现喘息的症状。从感染第1 ～ 6 天,羔羊BAL 中的病毒滴度增加了100 倍,肺部巨噬细胞、CD4+和CD8+细胞数量增加,IFN-γ、IL-8、MCP-1、MIP-1α 和RANTES 的mRNA水平有所增加[28]。

接种FI-hRSV 疫苗可预防羔羊感染病毒,并能防止肺组织病变的发展[29]。 接种疫苗后,虽然羔羊会出现广泛的细支气管周围细胞积聚,但其他肺病理损伤显著减少。 母源抗体(maternally derived serum antibodies,MDA)可以通过初乳转移到羔羊体内[30],用hRSV F 蛋白免疫怀孕母羊,在其血清和初乳中可诱导出高水平的病毒中和抗体。 羔羊从接种疫苗的母羊获得初乳,其病毒中和抗体滴度比未接种疫苗的母羊所生羔羊高50 倍左右。 2 ～ 3 日龄的羔羊受到hRSV 攻击后,与对照组相比,接种疫苗的母羊生出的羔羊肺病毒载量减少了70%,并且肺病理损伤明显减轻。 这些研究表明,母体免疫接种是一种安全有效的方法,可降低hRSV 对婴幼儿下呼吸道的损伤作用。

2.3 啮齿类动物

2.3.1 棉鼠

虽然棉鼠对病毒复制是半容许的,但它们每次接种病毒的剂量可以比BALB/c 小鼠高100 倍,但棉鼠并不出现临床症状[31]。 接种后,病毒在鼻、肺部呈高滴度复制,在气管呈低滴度复制。 棉鼠一生都对hRSV 易感,但病毒在3 d 龄棉鼠鼻腔中的复制量更大,持续时间也更长。 病毒抗原可以在鼻和肺纤毛上皮细胞中检测到,但在气管中检测不到病毒抗原,hRSV 感染会引起棉鼠肺部IFN-γ、IL-10、IL-6、MCP-1 和生长调节癌基因(growth-regulated oncogene,GRO)的mRNA 增加,并伴有鼻炎和轻度细支气管炎[32]。 在环磷酰胺免疫抑制的棉鼠体内,病毒载量更大,病毒排出时间更长,而且动物会产生以泡沫巨噬细胞、支气管和气管内碎片为特征的更严重的炎症反应[33]。

棉鼠和婴儿血清中的病毒中和抗体水平极为相似。 在被动免疫棉鼠的血清中,病毒中和抗体大于1 ∶380 就具有保护作用,而类似水平的母源抗体能够增强2 月龄以内人类婴儿对hRSV 的抵抗力[34]。 棉鼠在单克隆抗体类药物的研发中发挥了重要作用,是一种成熟的FI-hRSV 疫苗导致疾病加重的动物模型。 尽管FI-hRSV 疫苗减少了hRSV 的复制,但棉鼠出现了严重的毛细支气管炎、肺泡炎和间质性肺炎。 毛细支气管炎被认为是免疫介导的抵御hRSV 感染的正常组成部分,而在棉鼠模型中肺泡炎被认为是疫苗加重疾病的主要标志。 然而,FI-hRSV 免疫棉鼠肺泡炎的严重程度与非病毒抗原特异性T 细胞的启动有关,同时hRSV 抗原加重了这种反应[35]。 这些发现表明,在评估人类hRSV 候选疫苗的安全性时,不能完全套用棉鼠模型的结果。

2.3.2 小鼠

尽管近交系小鼠对hRSV 的易感性存在差异,但呈现中等易感性的BALB/c 小鼠已被广泛用于研究hRSV 的致病机制[36]。 鼻饲接种hRSV 后,病毒在小鼠的鼻腔和肺部复制。 小鼠一生都对hRSV 易感,但老年鼠比幼年鼠易感性更强[37]。 高剂量的hRSV(＞ 106pfu)是诱发疾病所必需的,其特征是体重减轻、毛发褶皱和驼背。 显微镜下的病变包括血管周围和细支气管周围单核细胞聚集,以及粘液分泌增加。 在感染急性期,促炎细胞因子和趋化因子水平升高。 小鼠的CD4+和CD8+T 细胞充当了“双刃剑”的角色,即在清除病毒和加重疾病中均发挥作用。 缺失CD4+或CD8+T 细胞,都会延长病毒感染时间,但却有利于症状缓解并减轻肺病理损伤[36]。 然而,这些观察结果与免疫抑制人群中出现的长时间排出病毒、严重的呼吸系统疾病和巨细胞肺炎形成了鲜明对比。

FI-hRSV 疫苗导致疾病加重的小鼠模型与引发Th2 反应有关,其特征是肺嗜酸性粒细胞增多、大量粘液分泌、体重减轻、气道阻塞、气道高反应性(airway hyper responsiveness,AHR)增加以及肺病毒载量减少。 当CD4+细胞缺失或敲除IL-4 和IL-10时,疫苗加重的病理表现就会消失[38]。 由FI-hRSV疫苗诱导的小鼠低亲和力非中和抗体,也被证明有助于加重AHR 和肺部病理损伤。 正如在其他动物模型中所见,对非病毒抗原的免疫反应会导致接种疫苗的小鼠病变增强。 然而,由于小鼠和人类在先天免疫和适应性免疫反应方面存在许多差异[39],小鼠对疫苗接种的反应可能与高等物种大不相同。例如,表达hRSV F 或G 蛋白的重组痘苗病毒可完全保护小鼠免受hRSV 感染[16,40],但对猕猴却没有诱导出保护作用[41]。

一个缺乏功能性CD8+T 细胞的人源化小鼠模型,在感染hRSV 106pfu 时,可导致小鼠体重减轻和肺组织损伤,其病理特征为细支气管周围炎症,BAL中以中性粒细胞占优势,粘液增多,这与hRSV 感染的儿童相似。 但野生型BALB/c 感染hRSV 后,BAL中性粒细胞的比例仅为10%[42]。 所以,与普通小鼠相比,人源化小鼠模型可能是评估hRSV 候选疫苗更适宜的模型。

2.4 非人宿主肺炎病毒的动物模型

2.4.1 bRSV 感染的犊牛模型

在天然宿主中研究非人类肺炎病毒的一个优势是宿主对病毒是完全允许的。 bRSV 感染的最高发病率出现在6 月龄以下的小牛,虽然母源抗体不能保护犊牛免受bRSV 感染,但呼吸系统疾病的发病率和严重程度与母源抗体水平呈负相关[43]。 感染潜伏期在2 ～ 5 d,临床症状包括鼻腔分泌物增加、咳嗽、呼吸急促、呼吸困难和发热。 bRSV 主要在纤毛气道上皮细胞和肺泡II 型细胞中复制,并诱导间质性肺炎、上皮坏死、渗出性或增殖性肺泡炎以及偶见合胞体的显微镜下病变。 中性粒细胞、脱落的上皮细胞、巨噬细胞和粘蛋白组成的细胞碎片会阻塞支气管和细支气管[44]。

bRSV 和hRSV 在整个基因组的同源性约为80%,而且对hRSV 具有特异性的多克隆抗体通常可识别bRSV 蛋白[5]。 目前犊牛已经被用于hRSV疫苗的评估[45],如DNA 疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗、重组病毒载体以及与佐剂混合的灭活bRSV,并用于确定母源抗体对疫苗接种的影响[43]。 犊牛也可以作为hRSV 候选疫苗临床前评估的一部分,这些候选疫苗含有hRSV 和bRSV 之间保守的蛋白质。 例如,用表达hRSV 融合蛋白F、N 和M2-1 的rAdV 鼻饲接种犊牛,并肌肉接种表达相同抗原的重组痘苗病毒加强免疫,可以使犊牛完全抵御bRSV的攻击[45]。

2.4.2 PVM 感染的小鼠模型

PVM 最初是从小鼠肺组织分离出来的[46],实验室小鼠感染PVM 导致疾病的严重程度取决于病毒剂量、小鼠品系和年龄。 BALB/c 鼠对PVM 易感,而C57BL/6 鼠对PVM 相对抵抗。 用小剂量(60～600 pfu)PVM 鼻饲接种BALB/c 鼠,病毒能在小鼠肺部复制到较高的滴度并引起严重的临床表现[6]。 病毒复制最初发生在肺泡细胞,随后在支气管上皮细胞,并诱导BAL 嗜酸性粒细胞增加,随后出现以中性粒细胞增加为主的反应。 肺组织病理改变包括肺泡上皮细胞凋亡、支气管上皮坏死、出血和粒细胞浸润。 PVM 感染小鼠肺部的促炎趋化因子和细胞因子反应与hRSV 感染小鼠相似。 然而,MIP-1α 参与PVM 诱导的炎症反应,却不能调控hRSV 诱导的小鼠炎症反应[47]。 这表明肺炎病毒在自然宿主和非自然的、半容许的动物模型中致病机理是存在差异的。

虽然PVM 小鼠模型的优势在于能够研究自然宿主中的肺病毒感染,但小鼠和人类之间先天性和适应性免疫反应的许多差异、肺部解剖结构的差异以及病毒蛋白的抗原差异限制了其与人类hRSV 的相关性。 尽管如此,了解PVM 的致病机制可以为更高级动物物种的研究提供参考。

3 结语

动物模型的选择必须基于多种因素,包括方法、试剂的费用和可用性。 此外,在设计动物实验时我们还要考虑其他因素,如病毒易感性和病毒对宿主免疫防御的适应性,这也决定了该模型对于理解人类病毒致病机制和免疫机制的适用性。

黑猩猩是唯一对hRSV 复制完全允许的动物宿主,允许动物间传播,但对实验硬件环境及研究经费要求较高;尽管我们可以使用分子生物学和遗传学方法对小鼠模型进行基因改造,但仍然无法使hRSV 完全适应小鼠,所以小鼠模型与hRSV 感染的相关性仍存在疑问;棉鼠更易受到hRSV 感染,并提供了上下呼吸道感染的模型,但目前的瓶颈是:可用于棉鼠研究的实验工具相对较少。

尽管对大型动物进行实验操作存在实际困难,但鉴于我们无法使hRSV 适应啮齿类动物模型,再加上hRSV 和bRSV 的密切关系,以及病毒传播动力学的相似性,所以bRSV 的致病机制和免疫特点等信息可以转化为治疗hRSV 感染和疫苗接种的改进策略。 那么为了保证病原体的宿主特异性,明智的做法是利用bRSV 及犊牛作为研究hRSV 的基础。 此外与啮齿类动物相比,牛的寿命更长,因此应该能够研究在数年而不是数周内记忆B 和T 细胞群对bRSV 抗原的反应,以及疫苗接种对牛寿命的影响。

综上所述,虽然每一种动物模型都有其适用的范围,但人们可依据研究目的综合考虑。 例如,在研究hRSV 疫苗过程中,研究人员可以首先选择bRSV 感染的犊牛作为动物模型进行长期的深入探讨,当获得稳定可靠的试验效果时,可将动物模型转向hRSV 感染的黑猩猩,以评估hRSV 疫苗的毒力和保护效力,为接下来临床试验的开展奠定基础。

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