兽用生物制品中支原体的污染来源及检测预防控制策略

于昌贵 葛兆宁/天津市中升挑战生物科技有限公司 300380

支原体属于自然界中结构最简单且体积最小的原核生物，滤菌器难以对其传播进行有效阻拦，同时支原体自身针对多方面的抗生素均能够体现出抗药性，相关的细胞器中含有浓度较高的粘附蛋白，可通过对真核细胞进行粘附，直接向细胞内部穿入。兽用生物制品的原材料包括动物组织、动物血液、原虫、微生物代谢产物以及微生物等多个方面，可针对动物传染病或其他相关疾病进行预防、治疗、诊断，属于一类免疫制剂，其安全性能够对动物健康以及人类健康起到直接或是间接的影响作用，所以针对兽用生物制品的生产质量予以充分重视，既有利于保障动物健康，也有利于维持人类社会的稳定和谐。当前支原体在自然界中已经被发现100 种左右，其均能够在一定程度上导致动物或是人类出现生长发育停滞、呼吸道感染以及免疫系统损伤等多方面情况，所以当前支原体已经吸引了医学界以及兽医界的广泛关注。由此可见，针对兽用生物制品中支原体的污染来源及检测预防控制策略进行分析具有重要意义。

1 兽用生物制品中支原体的污染来源

1.1 血清及胰酶血清属于疫苗生产过程中的主要原材料之一，被支原体污染的可能性较大，而且难以通过除菌过滤膜将其有效去除。胰酶则属于疫苗生产过程中进行细胞传代以及消化时必须应用的重要物料，主要来自于牛、猪、羊等牲畜的胰腺，易出现支原体污染情况。

1.2 细胞及种毒在疫苗生产过程中，种毒能够起到十分重要的影响作用，甚至能够决定疫苗的属性特点以及内在质量，如果种毒受到支原体污染，则能够出现逐级培养放大的情况，也就必然导致疫苗质量受到影响。并且，对细胞进行培养时，支原体污染同样能够产生较大的影响，一般来说，导致细胞出现污染情况的支原体主要来自牛、猪和人类，同时也包括梨支原体、猪鼻支原体、发酵支原体、口腔支原体、唾液支原体、精氨酸支原体等多种支原体，且其中部分来自于相关工作人员。

1.3 原代细胞及动物组织对猪瘟活疫苗进行生产的过程中，主要需要应用羊睾丸或是牛睾丸的原代细胞作为其中所需的原材料，但是牛、羊其自身即为易感支原体的动物，同时毛发较多，若出现消毒不全面、不彻底的情况，发生支原体污染现象的可能性将更大，所以应用动物组织作为兽用生物制品的原材料，极有可能出现支原体感染的情况，也就能够对接种动物造成严重威胁。

1.4 环境污染支原体能够在超净台内进行细胞传代，并且传播速度相对较快。与此同时，活支原体能够在其中存活至少4～6d，还能够成功实现复壮，且受到支原体污染的细胞传播结束之后，还能向干净细胞进行传递，且直至6 周以后，仍能够在其中检测出阳性，可见支原体不仅传播速度较快，且传播难度较低。

2 支原体检测方法

2.1 PCR 法PCR 法具有灵敏度高、特异性强、检测时间短、重复性良好、产率高、易自动化等多方面优势，但与此同时，其中假阴性、假阳性出现的可能性也相对更大，对相关工作人员提出了更多更高的要求。其主要可以针对巴氏杆菌、沙门氏杆菌、猪链球菌、大肠杆菌、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、二型猪瘟病毒、新城疫病毒等多项病原的扩散情况进行有效检测，可见该方法在兽用生物制品的生产质量控制工作中能够体现出较高的应用价值，同时，其在相关的疫苗质量检验工作中应用效果也较为良好。

2.2 一步法试剂盒检测法一步法试剂盒中所应用的原理在于环介导等温扩增技术，其具有操作简单的优势，仅需1μL 的加样量，即能够借助变色情况对检测结果进行判定。从整体上来看，该检测方法周期较短，检测结果可用肉眼直接观察，并且具有较高的检测准确率。

2.3 ELISA 法根据“ELISA 抗体夹心法”原理，某公司研制并推广了支原体检测试剂盒。该试剂盒可以有效避免出现假阴性和假阳性的情况，不仅操作过程便捷，且省时省力，同时结果准确性较高，并能够体现出高通量、高灵敏度和价格低廉的优势。首先在样品上标注地高新标签和生物素标签，再针对孔板使用预先包被对链亲和素进行获取，之后加入抗地高新检测抗体，且需注意，在将该抗体加入之前，需首先进行碱性磷酸酶标记，最后将底物显色加入其中，采用比色法获取检验结果，以判定其中是否存在支原体。

2.4 分离培养法在固体培养基或是液体培养基之中，均可应用分离培养法开展分离培养工作，在固体培养基之中，多数支原体能够呈现出典型的菌落，在液体培养基之中，支原体则能够呈现出pH 值得显著变化，由此可见，分离培养法的应用效果良好，但同时该方法敏感性不足、培养时间相对较长，同时受到抗生素自身影响的可能性较大，且不能将其中存在的全部支原体有效检出。当前《中国兽药典》相关内容仍指定分离培养法作为开展支原体检测工作的基本方法，但是在实际上，我国兽用生物制品企业的生产和发展，均需有更加先进、更加有效的快速检验方法支持工作，所以针对分离培养法，需要进行进一步的优化完善，或是与其他方法进行联合应用，以促使其中的支原体检出率得到有效提升。

3 预防支原体污染方法

3.1 环境控制针对生产车间，应保持其中的卫生环境良好，定期开展清洁工作和消毒工作，并需要定期检测其中的卫生情况，以保障其中各项参数均处于标准范围内，且持续可控。在进行生产的过程中，需要针对流程之中的各项工作环节进行持续细化，严格控制工作人员、物品、以及污物出入的路径，以尽可能降低交叉感染情况出现的机率。生产工作结束后，应彻底消毒生产设备，并根据各项设备及器械的实际特点，采用消毒水浸泡的方式或是高压灭菌的方式对其进行消毒处理，且车间内清洁区的全部物品，均应使用紫外线照射或是表面消毒的方式进行处理。

3.2 原材料控制血清、胰酶、细胞一类的动物源性原材料在兽用生物制品之中，均属于占据重要地位的生产材料，同时也是支原体生存的重要基础。根据相关研究显示，当前血清或细胞的原材料，能够导致至少20 种支原体发生污染，所以不仅需要保障无菌状态，还应该在开展应用之前，强化相关的支原体检验工作，以尽可能避免出现支原体污染扩散的情况。与此同时，在开展细胞培养工作的过程中，相关人员还应注意保持个人卫生习惯良好，同时完全遵循操作规范，以降低支原体污染情况出现的几率，之后还应以相关制度为基础，对检验体系进行持续完善，严格检验种细胞、原代细胞以及带代次细胞，以保障细胞中不会出现支原体污染的情况。另外，针对新引进的细胞或是种毒，应该首先进行隔离培养工作，确认检验结果合格，方可应用于车间生产工作。

3.3 消毒灭菌采用正确的消毒灭菌处理方法，有利于控制各种微生物以及污染物滋生，所以，一方面，需要针对生产生物制品过程中需要应用的全部物品以及器具，开展全面彻底的消毒灭菌工作，确认无菌测试结果合格，方可再次投入到使用当中，以能够从源头处开始对污染物的产生起到有效的控制作用，另一方面，应该注意，其中应用的消毒灭菌方法正确与否，例如干热烤箱或是高压锅中大量堆积物品，则可能导致出现加热不均的情况，也就能够引起灭菌不彻底的情况，或是在进行灭菌工作时，存在循环时间过短的现象，特别是其中液体剂量已经超过500mL，或是其中含有淀粉、琼脂一类的胶质物质，能够导致灭菌效果大幅度降低，所以在开展消毒灭菌工作的过程中，还需要对灭菌材料的性质、质量、尺寸、体积等各个方面进行充分考虑和合理协调，以保障消毒灭菌工作效果良好。

3.4 合理应用抗生素将抗生素应用于支原体污染之中，可以起到较好的抑制作用，所以在开展生物制品生产工作的过程中，需要对抗生素进行合理应用，以降低支原体污染情况出现的机率。但是从实际上来看，支原体对于一般抗生素普遍不具有良好的敏感性，甚至存在抗药性，所以需要提升抗生素选择的合理性，在保持用药剂量科学合理的同时，尽可能不对细胞正常功能产生影响，并在此同时对支原体污染情况进行有效控制。

4 结语

支原体属于一类病原微生物，针对人体或动物均能够产生致病性，一旦生物制品受到支原体污染，其品质将能够出现大幅度的下降，而支原体污染这一情况能够体现出隐蔽性特征，所以还需针对相关的原材料以及环境加强检验和控制工作，以保障兽用生物制品的质量。当前兽用生物制品的生产厂家所应用的筛查方式虽然快捷有效，但是相对于与相关标准来说，仍然不够完善，所以有必要根据实际情况对管理制度进行进一步的规范，并严格控制各个操作环节，以能够将潜在的污染风险完全排除。