HPLC 和HPLC-MS 法检测配制酒中甜蜜素含量测量不确定度的比较研究

毛琼丽，李先芝，2，严 玲，石 豪，刘 洋，胡 杨，朱 艳，杨 峰，陈彦和

（1.劲牌有限公司，湖北大冶 435112；2.中药保健食品质量与安全湖北省重点实验室，湖北大冶 435112）

甜蜜素又名环己基氨基磺酸钠，是一种人工合成甜味剂，由于其甜度高而常被用作食品生产中的添加剂，但有研究表明过量甜蜜素会对脏器产生一定危害，造成某些生理指标的改变。我国颁布的GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中对甜蜜素在酒类产品中的使用仅限定于配制酒，维护了消费者的健康权益。近年来国家各级监管部门对酒类产品的食品安全监管力度加强，为酒企对酒类产品质量提升和行业的可持续发展提供了契机，甜蜜素的检测方法也有所改进，其中由于气相法在检测白酒中甜蜜素时易产生假阳性现象，改进后国标GB 5009.97—2016《食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定》中方法的适用范围标明：液相色谱法适用于配制酒，液相色谱-质谱法适用于白酒中甜蜜素的测定。而随着新的《白酒工业术语》和《饮料酒术语和分类》标准即将颁布实施，市场中的部分“白酒”产品将划归入“配制酒”。为研究及评价液相、液相色谱-质谱法检测配制酒中甜蜜素含量的可接受性，本文根据CNAS-GL06：2019《化学分析中不确定度的评估指南》相关要求及方法，分别对《食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定》中液相色谱法与液相色谱-质谱法的测量不确定度进行量化评估，通过对比，综合分析两种方法对测量结果影响较大的因素，为正确评价和使用配制酒类产品中甜蜜素的检测方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

试剂及耗材：甲醇(CHOH)，色谱纯；乙酸铵(CHCOONH)，色谱纯；次氯酸钠(NaClO)，分析纯；硫酸（HSO），分析纯。甜蜜素，含量99.3 %，中国计量科学研究院；配制酒，市购。

仪器设备：液质联用仪，三重四级杆质谱仪（ACQUITY TQD），沃特世（Waters）公司；色谱柱，Xselect HSS T3（2.1×100 mm，3.5 μm）；AB135-S电子天平（十万分之一），梅特勒-托利多仪器公司。

液相色谱仪：高效液相色谱仪（Agilent 1260），安捷伦科技有限公司；色谱柱：Sepax Hp-C柱（4.6×250 mm，5 μm）。

1.2 测定方法

分别按照GB 5009.97—2016《食品安全国家标准食品中环己基氨基磺酸钠的测定》中第二法：高效液相色谱法，第三法：液相色谱-质谱/质谱法开展样品测定。每种方法测定流程如下：①样品前处理（平行操作六份）；②制备系列标准溶液；③测定标准溶液，拟合标准曲线（直线）方程；④测定试液，检测样品试液的峰面积；⑤计算测得浓度。

2 测量模型

根据测定方法建立样品中甜蜜素检测的数学模型：

式中：X 为试样中甜蜜素的含量，mg/kg；C 为样品浓度，μg/mL；V为试样定容体积，mL；m为试样称样量，g。

3 不确定度的来源识别

根据方法的测定过程以及测量模型，分析影响液相法与液相色谱-质谱法测定食品中甜蜜素的不确定度来源主要有：①样品称量时引入的不确定度；②样品稀释过程中引入的不确定度；③标准物质称量时引入的不确定度；④标准溶液稀释时引入的不确定度；⑤标准曲线拟合引入的相对不确定度；⑥方法重复性测试引入的不确定度；⑦方法加标回收率引入的不确定度。甜蜜素含量测定不确定度来源分析因果图如图1所示。

图1 甜蜜素含量测定不确定度来源分析

4 不确定度的评定

4.1 样品称量时引入的不确定度

4.1.1 天平允差引入的不确定度

4.1.2 重复性产生的相对标准不确定度

4.1.3 样品称量引起的相对标准不确定度计算

按照以上计算方式，对样品处理过程中称量引入的不确定度进行计算u=0.00001，u=0.00003。

4.2 样品处理过程中稀释引入的不确定度

4.2.1 校准引入的不确定度

表1 样品处理过程中玻璃量具引入的不确定度

4.2.2 环境温度变化引入的不确定度

4.2.3 重复性产生的相对标准不确定度

4.2.4 玻璃量具引入的相对标准不确定度

各玻璃量具引入的相对标准不确定度计算公式如（7）：

按照以上计算方式，对样品处理过程中稀释所用到的玻璃量具引入的不确定度进行总结.

结合样品处理过程，液相和液相色谱-质谱法由定容体积引入的相对标准不确定度为：

4.3 标准溶液制备引入的不确定度

4.3.1 标准物质的相对不确定度

标准物质校准证书中估计值引入的不确定度：甜蜜素标准物质由中国计量科学研究院提供，纯度I 为99.3 %，标准证书给出的相对扩展不确定度U为0.8%，包含因子k 为2，其引入的相对标准不确定度为：

4.3.2 标准物质称量引入的不确定度

称量重复性产生的不确定度：重复称量10 次，得到称量标准物质时引入的标准偏差为u2=0.00008 g。

液相方法和液相色谱-质谱方法所用标准物质称量均为0.1 g，所引入的相对标准不确定度均为：

4.3.3 配制标准物质溶液玻璃量具引入的不确定度

液相法标准溶液配制过程中，使用A 级50 mL容量瓶5 次，A级100 mL容量瓶1次，容量允差分别为±0.05 mL、±0.10 mL；使用A 级10 mL 单标移液管6次，25 mL单标移液管4次，允差分别为±0.020 mL、0.030 mL。按4.2 的方法计算出液相法标准物质配制时玻璃量具引入相对标准不确定度。

液相色谱-质谱法标准溶液配制过程中，使用A 级10 mL 容量瓶6 次，A 级100 mL 容量瓶2 次，允差分别为±0.02 mL、±0.10 mL；使用A 级1 mL 单标移液管1次，A级2 mL单标移液管3次，A级5 mL单标移液管3 次，允差分别为±0.007 mL、±0.010 mL、±0.015 mL，按4.2 的方法计算出玻璃量具引入的相对标准不确定度。

经计算，各玻璃量具引入的相对标准不确定度如表2。

表2 标准溶液配制过程中玻璃量具引入的不确定度

结合标准物质溶液的配制过程，液相和液质检测方法由玻璃量具引入的相对标准不确定度为：

综上，标准溶液配制引入的相对标准不确定度为：

4.4 标准曲线拟合引入的不确定度

4.4.1 液相法标准曲线拟合引入的不确定度

对液相方法的一元线性回归的标准不确定度开展评定，首先以液相法配制的标准物质溶液浓度及得到的甜蜜素峰面积拟合线性方程，所建立的标准曲线为Y=2.4175C-1.2764，R=0.9998，其中斜率a=2.4175，截距b=-1.2764，测量样品溶液次数p=6，标准曲线测量定次数n=5，被测供试品溶液浓度平均值为20.9035 mg/L，计算液相法标准曲线的残差标准偏差S为：

根据计算：S（液相）=2.6053 mg/L；

计算液相色谱-质谱法标准不确定度为：

其相对不确定度为：

4.4.2 液相色谱-质谱法标准曲线拟合引入的不确定度

以液相色谱-质谱法所建立的标准曲线为Y=7.6647C-83.2332，R=0.9993，其中斜率a=7.6647，截距b=-83.2332，测量样品溶液6 次，被测供试品溶液浓度平均值为164.1183 μg/L，按式17、式18 计算其残差标准偏差S（液质）=37.8748，标准不确定度为：=2.9924μg/L，则u=0.01823。

4.5 方法重复性测定引入的不确定度

液相法样品重复测定引入的标准不确定度：

液相法样品重复测定的相对标准不确定度：

以同样方法开展液相色谱-质谱法对配制酒样品中甜蜜素进行重复测定，重复测定次数n=6，测定 值X分 别 为165.2891 μg/L、163.3291 μg/L、165.2393 μg/L、164.9185 μg/L、161.8283 μg/L、164.1055 μg/L，均值x¯=164.1183 μg/L，计算其标准偏差s(x 液质)=1.3517 μg/L，标准不确定度u=0.55181 μg/L，液相色谱-质谱法重复性测定引入的相对标准不确定度u=0.00336。

4.6 方法加标回收率引入的不确定度

4.7 合成标准不确定度

分别以两种方法的相对标准不确定度分量计算相对合成标准不确定度u，计算公式如下：

经计算，两种方法检测甜蜜素的相对合成标准不确定度为：u=0.04178，u=0.02393。

液相法所测定的配制酒样品中含甜蜜素41.80 mg/kg，液相色谱-质谱法测定的配制酒样品中含甜蜜素1.64 mg/kg，两种方法的合成标准不确定度为：

4.8 扩展不确定度的评定

在95%的置信水平下，取包含因子k＝2，扩展不确定度按式28计算，得到液相法测定甜蜜素的扩展不确定度为U=3.49 mg/kg，高效液相-质谱法测定甜蜜素的扩展不确定度为U=0.08 mg/kg。因此，高效液相色谱法测定的配制酒中甜蜜素含量测定结果表示为（41.80±3.49）mg/kg，高效液相-质谱法测定的配制酒中甜蜜素含量测定结果表示为（1.64±0.08）mg/kg。

4.9 不同方法下不确定度评定对比

通过开展配制酒类中甜蜜素检测液相法和高效液相-质谱法的不确定度评定对比，各分量值见图2，液相色谱-质谱法的相对不确定度值小于液相色谱法。对相对不确定度评定过程中各分量值进行分析，影响两种方法测量结果不确定度的主要因素是：标准溶液的配制和标准曲线的线性拟合。液相色谱-质谱法中回收率标准不确定度对结果的不确定度也有较大影响。

图2 HPLC与LC-MS测定配制酒中甜蜜素相对不确定度分析

5 小结

降低测量结果的不确定度，减小线性拟合过程引入的不确定度值，可以通过以下方式对实验进行优化与改进：①选择对化合物响应值更高的仪器，以增加线性曲线的斜率a 值；②通过预实验了解样品浓度范围，选择配制合适的标准物质浓度区间，使供试品溶液浓度尽量接近曲线中点；③增加供试品溶液测试次数；④增加标准曲线溶液测定次数。

检测过程中，如果供试品溶液浓度很低，在某一方法的检出限或定量限附近，无法通过调整曲线浓度使供试品溶液浓度接近曲线中点，其检测结果的相对不确定度值将较高，此时则需要选择灵敏度更高、检出限更低的仪器，尽量使得供试品溶液浓度在曲线浓度的中间位置。

在实际检测过程中，需要尽量规范操作，减小标准溶液配制时定容和移液过程的重复性标准偏差、提高样品检测过程中的重复性和回收率，对减小检验结果的不确定度也有所帮助。