阿拉尔市售鸽蛔虫种类的分子鉴定

信璐瑶 石帅锋 刘祥杰 齐萌 王云峰 邓金华 余复昌

摘 要：为了解阿拉尔市售鸽的蛔虫感染种类，采用剖检法对从阿拉尔市农贸市场购买的110羽鸽进行检查，发现14羽感染蛔虫，感染率为12.7%（14/110）;共获虫体188条，最大感染强度为48条/羽。随机提取10条虫体DNA，分别基于线虫SSU rDNA、nad2和cox1基因位点进行PCR扩增和测序，结果显示：所获虫体的SSUrDNA和nad2基因序列与鸡尾鹦鹉蛔虫同源性分别为99.9%和100%;cox1基因序列与鸽蛔虫同源性为97.9%;鉴定本次分离的虫体为鸡尾鹦鹉蛔虫。进化分析显示，本次所获鸽源蛔虫分离株与鸡尾鹦鹉蛔虫分离株聚类在一支，而与其他属蛔虫处于不同分支。研究结果为鸽源蛔虫的种类鉴定提供了基础资料。

关键词：蛔虫;鉴定;种类;鸽

中图分类号：S836 文献标识码：B 文章编号：1673-1085（2022）02-0005-06

蛔虫病是鸽常见的肠道寄生虫病，可引起翅膀下垂、羽毛蓬乱、呆立萎靡、飞行能力降低和异嗜癖等症状，在我国各地广泛流行[1]。蛔虫发育不需要中间宿主，主要是感染性阶段的蛔虫卵通过污染用具、饲料、饮水等途径传播和感染。蛔虫可感染各年龄段鸽，临床症状表现主要跟感染强度呈正相关，感染强度大时可导致鸽群发生死亡，对养鸽业造成较大的危害[2]。报道显示，寄生于禽类的蛔虫种类至少有8种，我国禽类常见感染的种类有鸡蛔虫（Ascaridia galli）、鸽蛔虫（Ascaridia columbae）和鸡尾鹦鹉蛔虫（Ascaridia nymphii），其中鸡蛔虫和鸽蛔虫均可感染鸽，鸡尾鹦鹉蛔虫主要感染鹦鹉[3]。

传统的蛔虫分类鉴定是对成虫虫体进行形态学观察，该法简单便捷，但需要经验丰富者进行鉴定，形态相近的種类不能有效区分，具有一定局限性。分子生物学技术在寄生虫种类鉴定方面具有较好的特异性和敏感性，可通过序列差异揭示物种间的系统进化关系，常用的蛔虫分子标记有核糖体内转录间隔区（ITS）、细胞色素C氧化酶亚基I（cox1）、核糖体小亚基（SSU rDNA）和烟酰胺脱氢酶亚基II（nad2）等[1，4]。

随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，人们对鸽产品的市场需求不断增加，肉鸽养殖已成为新兴家禽产业之一。新疆南疆地域广泛，人口密度低，自古有肉鸽养殖的传统，近年来为促进当地就业和经济发展，政府大力倡导肉鸽产业发展[5]。然而，受多种因素影响，新疆南疆地区肉鸽养殖以农牧民和小型养殖场为主，养殖人员疫病防治知识水平偏低，饲养管理水平不高。为了解阿拉尔市售鸽感染情况及其种类，采用系统剖检法和PCR法对鸽进行调查和检测，以期为鸽蛔虫病的防治提供基础研究资料。

1 材料与方法

1.1 鸽的蛔虫样本收集

自阿拉尔市农贸市场购买110羽鸽，采用系统剖检法进行剖检。经肉眼观察，将在腺胃、肌胃及肠道内发现的蛔虫成虫，置于70%乙醇中保存。

1.2 蛔虫虫体DNA提取

从鸽体内检出的所有蛔虫中，随机选取10条蛔虫，各剪一段5 mm虫体，分别置于无菌的1.5 mL离心管中，充分研磨后，采用组织基因组DNA提取试剂盒（北京全式金生物技术有限公司产品）按照操作说明步骤提取虫体DNA，置-20 ℃长期保存。

1.3 PCR扩增

参考文献报道[3，4，6]分别设计线虫通用的SSU rDNA、nad2和cox1基因的引物序列，由苏州金维智生物科技有限公司合成，引物序列和反应程序见表1。

PCR扩增反应体系为25 µL：2× EasyTaq PCR SuperMix （北京全式金生物技术有限公司产品）12.5 µL，双蒸水 10.9 µL，上下游引物各0.3 µL，DNA 模板1 µL。PCR反应结束后，取5 µL第二轮PCR产物加入1%的琼脂糖凝胶胶孔中，110 V电压电泳30 min，置凝胶成像分析系统中观察并拍照。

1.4 序列比对和种系发育分析

成功扩增的PCR产物均进行双向测序，由苏州金维智生物科技有限公司完成。测序所获序列，在NCBI数据库中进行BLAST同源序列搜索，用Clustal X 2.1软件进行比对分析，根据比对结果鉴定蛔虫种类。下载相关蛔虫同源序列，采用Mega 6.0软件，选择邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建种系发育进化树，其可靠性用Bootstrap分析检测，进行1 000个重复。

2 结果

2.1 鸽的蛔虫检查和PCR扩增结果

对110羽鸽进行剖检，肉眼观察发现有14羽感染蛔虫，感染率为12.7%（14/110）。14羽呈蛔虫感染阳性的鸽中，最大感染强度为48条/羽，共收集蛔虫虫体188条。

分别基于SSU rDNA、nad2和cox1基因位点，采用PCR法扩增随机选取的10条蛔虫DNA样本，分别扩增出约845、266 bp和450 bp的条带，与目的片段相符，分别见图1、图2和图3。

2.2 鸽的蛔虫序列分析

在SSU rDNA基因位点，成功获得10条蛔虫序列，序列一致，均与来自日本的鸡尾鹦鹉源鸡尾鹦鹉蛔虫（LC057210） 同源性为99.9%，存在1个碱基差异，在第25核苷酸位置存在插入碱基A。

在nad2基因位点，成功获得10条蛔虫序列，序列一致，均与来自日本的鸡尾鹦鹉源鸡尾鹦鹉蛔虫（LC061195） 同源性为100%。

在cox1基因位点，成功获得10条蛔虫序列，序列一致，均与甘肃鸽源鸽蛔虫（JX624729） 同源性为97.9%，存在5个碱基差异，分别在801、858、936、954和1086核苷酸位置存在A→G，T→C，A→G，C→T和A→G，提示其存在种类差异。

通过序列分析，鉴定本调查所获蛔虫均为鸡尾鹦鹉蛔虫。

2.3 鸽的蛔虫序列种系发育分析

基于SSU rDNA基因序列构建的进化树显示，本调查所获鸽的蛔虫序列与日本鸡尾鹦鹉源和我国广东金刚鹦鹉源鸡尾鹦鹉蛔虫序列聚集在一支，与美国鸡源鸡蛔虫聚类构成1个亚群结构，而与其他属蛔虫形成不同的亚群分支 （图4）。

基于nad2基因序列构建的进化树显示，本调查所获鸽的蛔虫序列与日本鸡尾鹦鹉源鸡尾鹦鹉蛔虫单独聚类构成1个亚群，而与其他属蛔虫形成不同的亚群分支 （图5）。

基于cox1基因序列构建的进化树显示，本文获得的序列与我国甘肃鸽源鸽蛔虫单独聚类形成1个亚群（图6）。

3 讨论

蛔虫是鸽体内的大型寄生线虫，时常引起群体感染，造成一定的经济损失。对线虫进行种类鉴定通常以形态学方法对虫体进行结构特征观察，但要求观察者是经验丰富者，且步骤较为繁琐。目前，分子生物学技术已成为寄生虫分类鉴定常用方法之一。Yang等[3]基于18S rDNA基因、ITS rDNA基因和nad4基因对广东的金刚鹦鹉的蛔虫鉴定，结果为鸡尾鹦鹉蛔虫;Abe等[4]通过nad2基因对来源于日本鸡尾鹦鹉的蛔虫研究发现，所获得的虫体是与鸽蛔虫高度同源的鸡尾鹦鹉蛔虫;李佳缘等[7]基于cox1基因对来源于广东、云南、湖南的8条鸡的蛔虫进行扩增，结果发现在该位点鸡蛔虫与其他蛔虫存在较大种间差异。本次调查发现，在SSU rDNA和nad2基因位点所获鸽源蛔虫序列与日本的鸡尾鹦鹉源鸡尾鹦鹉蛔虫序列的同源性分别为99.9%和100%，与上述报道相一致，提示不同宿主来源和不同地理来源的鸡尾鹦鹉蛔虫存在一定的差异。在cox1基因所获鸽源蛔虫序列均与我国甘肃鸽源鸽蛔虫存在5个碱基差异，提示存在种类差异，其应该是不同的种;由于目前禽源蛔虫cox1基因序列尚较少，其种系进化发育有待于进一步分析。本研究结果为鸽源蛔虫的种类鉴定提供了基础资料。

造成鸽蛔虫病的发生主要是因为饲养环境卫生差、饲料营养不均衡、养殖技术低、防病意识差等因素，防治鸽蛔虫病应做好鸽舍的清洁工作，及时清除粪便，保证饲料和飲水卫生，选用优质混合料，定期驱虫，发现病例及时隔离治疗等[8]。

参考文献：

[1] 李金平，张浩吉，梁详解，等. 鸽蛔虫ITS rDNA的克隆与序列分析[J]. 湖北农业科学， 2012，51（18）： 4138-4140.

[2] Mehmood S， Nashiruddullah N， Ahmed JA， et al. Parasitic affections of domesticated pigeons （Columba livia） in Jammu， India[J]. Ann Parasitol， 2019， 65（1）：53-64.

[3] Yang F， Zhang P， Shi X， et al. New record of Ascaridia nymphii （Secernentea： Ascaridiidae） from macaw parrot， Ara chloroptera， in China[J]. Parasitol Int.， 2018， 67（3）：309-312.

[4] Abe N， Matsuo K， Makino I. Ascaridia nymphii n.sp. （Nematoda：Ascaridida） from the alimentary tract of a severely emaciated dead cockatiel Nymphicus hollandicus[J]. Parasitol Res.， 2015， 114（11）：4281-4288.

[5] 肖长峰，吕文纬，朱丽慧，等. 我国肉鸽养殖产业存在的问题与对策分析[J]. 上海畜牧兽医通讯，2020（2）： 2.

[6] 伍慧兰，谭美英，刘国华，等. 湖南省鸡蛔虫线粒体cox1和nad1基因的序列测定及种系发育分析[J]. 畜牧兽医学报， 2010，41（12）： 1592-1597.

[7] 李佳缘，刘国华，王燕，等. 鸡蛔虫线粒体cox1基因的克隆及序列分析[J]. 中国畜牧兽医，2012，39（05）： 41-43.

[8] 苏咏梅，陈娟，马晓英，等. 鸽蛔虫病的诊断报告[J]. 经济动物学报，2009，13（02）： 123-124.

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