大葱伴生甜瓜栽培对根际土壤酶活性和细菌群落的影响

倪 栋 陈应素 李 爽 汤雨凡 刘翔毓 殷 乐 周艳丽,*

(1 吉林农业大学园艺学院，吉林 长春 130118；2 吉林农业大学教研基地管理处，吉林 长春 130118； 3 吉林农业大学资源与环境学院，吉林 长春 130118；4 吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118)

甜瓜(CucumismelonL.)是一种高营养价值、高经济价值的作物，近年来成为吉林省夏季日光温室和塑料大棚主栽经济作物之一，然而栽培地未经科学规划、过度利用以及滥用农药、肥料等[1]，导致甜瓜根际土壤的微生态环境恶化，严重影响了甜瓜的生长发育，使甜瓜品质下降并且大幅减产。因此，当务之急是解决甜瓜生产困境。目前，基于绿色、可持续发展的理念，在生产上常利用化感作用进行不同植物间栽培，以期达到绿色有机生产的目的。伴生栽培是在园艺生产中常见的一种以收获主栽作物为目的的特殊间作模式。

伴生栽培是将2种或2种以上生长季节相近或相似的作物按一定比例分行或分带种植在同一田地上的一种精耕细作、集约化种植的传统技术[2-3]。夏秀波等[4]研究证明大葱伴生能够促进番茄植株生长，延缓叶片衰老；有研究证明分蘖洋葱伴生能够提高番茄根际土壤微生物的多样性，并且能够增强植株的抗病能力[5-6]。葱蒜类蔬菜因具有独特的抑菌特性和田间土壤生态环境改良效应，现已受到越来越多的重视，目前对葱蒜类蔬菜的开发和利用也逐渐走向多元化。通过近年针对大蒜(AlliumsativumL.)[7-8]、分蘖洋葱(AlliumcepaL.)[9-10]和大葱(AlliumfistulosumL.)[4]缓解土壤连作障碍的研究发现，主栽作物分别与这3种作物轮作、间作、套作、伴生、填闲等栽培方式，不仅可以增加地上部的物种多样性[11]，而且可以通过根系分泌物对土壤微生态环境起到调控作用，进而抑制病原微生物的生长[12]，促进幼苗植株生长。

土壤微生态环境的变化情况直观反映了伴生栽培的作用。微生物能对土壤中的生物残体[13]及有机物进行转化、水解，同时对土壤养分的增加有促进作用，是土壤中最活跃的部分之一[14]。研究表明微生物群落结构的组成是反映土壤中物质代谢旺盛程度的重要指标之一[15]。细菌是构成土壤微生物的主要生物量之一，占整个土壤微生物群落的70%～90%，并且在维护土壤健康、拮抗土传病害等方面做出了积极贡献[16]。细菌在土壤中发挥的重要作用直接体现在土壤的肥力状况上[17]，并最终影响植物的生长[18]。土壤微生物数量和群落结构[19]等方面的初期研究大多采用的较早的生物技术，如变性梯度凝胶电泳(pcr-denaturinGGradienTGel electrophoresis，PCR-DGGE)技术[19]、Biology技术[20]，仅能检测土壤微生物的优势菌落，而无法检出组成占比低的微生物。随着现代高通量测序技术的推广及应用，土壤微生物中的优势物种、稀有物种及部分未知物种都可以被检测出来[21]。为此，本试验基于土壤农化性质测定、土壤酶测定、高通量测序方法，分析大葱伴生栽培对甜瓜根际土壤中细菌群落结构阶段变化的影响，综合评价根际土壤农化、酶活性与土壤细菌群落结构的互作效应，并通过后期对甜瓜果实进行测产来验证伴生栽培的效果，以期为建立适合甜瓜持续适效的栽培模式提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试验地概况

供试材料薄皮甜瓜品种为景路甜蜜王，大葱品种为普威长夏，均购自吉林省长春市种子市场。试验于2020年6月至12月在吉林农业大学园艺学院蔬菜生产基地(125°27′E，43°46′N)进行，栽培土壤类型是黑壤土，其养分性状：pH值7.02，有机质58.35 g·kg-1，碱解氮99.47 mg·kg-1，速效磷201.24 mg·kg-1， 速效钾701.25 mg·kg-1。

1.2 试验设计

试验设4个处理，分别记作DZ1、BS1、DZ3、BS3，详见表1。于2020年6月18日，将温室原土和商品鸡粪按9∶1的比例搅拌均匀装盆，然后将5株株高20 cm的葱沿着26 cm×21 cm营养钵的边缘均匀地移栽到盆中。6月20日直播甜瓜种子于营养钵的中心位置，每盆3粒。营养钵按照45 cm×90 cm的株行距半埋在温室内。在甜瓜两叶一心时进行间苗，选留一株健壮秧苗，5～6片真叶时去掉主蔓生长点，选留两条长势一致的子蔓，抹掉孙蔓侧芽，吊蔓栽培，分别在第7和第15节留瓜，每条子蔓留两瓜，每株四瓜，待子蔓生长至20片叶时摘心，常规田间管理。栽培期间追肥一次，在果膨大期随水施入磷钾复合肥，施入量为每盆12 g。本试验每个处理设置30盆，4个处理共120盆。

表1 试验处理Table 1 TesTTreatment

1.3 测定项目与方法

1.3.1 产量及果实品质测定 在2020年9月18日(播种90 d后)采收甜瓜果实。甜瓜果实硬度采用FT-327水果硬度计(北京金科利达电子科技有限公司)测定；可溶性固形物采用MHY-22747手持式糖量计(北京美华仪科技有限公司)测定；根据平均单果重、单株结瓜数和栽培密度统计单株产量和亩产。

1.3.2 土壤性质测定 分别于2020年7月30日(播种40 d后)和2020年9月8日(播种80 d后)采用抖根法[22]采集土样，每个处理随机选取5盆，取土壤表层下15 cm的土样，约200 g。样品采集后仔细去除新鲜土样中可见的植物残体及其他杂质，将其中部分土放入无菌离心管中，置于液氮内速冻，然后置于-80℃ 超低温冰箱中保存，用于土壤细菌群落结构分析；另一部分土壤样品经自然风干后过100目筛，用作测定土壤农化理化及土壤酶活性。

土壤农化性质测定参照《土壤农化分析》[23]。土壤pH值采用F-74酸度计(日本HORIBA)测定；土壤有机质含量采用重铬酸钾消煮容量法测定；土壤碱解氮含量采用碱解扩散法测定；土壤速效磷含量采用钼锑抗比色法测定；土壤速效钾含量采用火焰光度法测定。

土壤酶活性测定参照《土壤酶及其研究法》[24]。土壤脲酶活性采用靛酚蓝比色法测定；土壤酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定；土壤蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定；土壤过氧化氢酶活性采用比色法测定。土壤漆酶活性采用活性光度法测定[25]。

土壤细菌群落检测土样送于诺禾生物科技有限公司并基于高通量测序技术完成细菌群落结构分析。利用诺禾生物科技公司提供的Novomagic云数据分析平台进行根际土壤细菌多样性分析，构建物种组成群落图。

1.4 数据分析

试验数据采用Microsoft Excel 2016软件进行处理，数据的多重比较使用DPS数据处理系统。

2 结果与分析

2.1 伴生对甜瓜果实产量及品质的影响

伴生对甜瓜果实品质和产量的影响见表2。伴生处理与单作处理的甜瓜果实可溶性固形物含量、果实硬度均无显著差异；伴生处理的单果重、单株产量以及亩产均显著高于单作处理，伴生处理单果重和亩产分别较单作增加13.1%和12.7%。整体来看，伴生栽培可以促进甜瓜生长，进而增加单果重及产量。

表2 伴生对甜瓜果实品质和产量的影响Table 2 Effects of companion on fruit quality and yield of muskmelon

2.2 伴生对根际土壤农化性质及土壤酶活性的影响

由表3可知，播种40 d后，伴生处理土壤的pH值、有机质含量、碱解氮含量、速效钾含量均低于单作处理，速效磷含量高于单作处理；另外，伴生处理的土壤脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶、过氧化氢酶、漆酶活性均高于单作处理，其中脲酶和漆酶活性差异达显著水平。播种80 d后，伴生处理的土壤pH值、有机质、速效磷含量高于单作处理，其中速效磷含量显著高于单作处理，而碱解氮、速效钾含量则显著低于单作处理；此外，伴生处理的土壤脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶、漆酶活性均显著高于单作处理。

表3 不同处理的土壤农化性质和土壤酶活性Table 3 Soil agrochemical properties and soil enzyme activities of the soil treated with different ways

2.3 伴生对根际土壤细菌群落结构的影响

2.3.1 根际土壤细菌多样性分析 伴生对根际土壤细菌多样性的影响见表4。随着栽培时间的延长，伴生处理土壤细菌的Ace指数、Chao1指数、Shannon指数整体呈降低趋势。播种80 d后伴生处理的Shannon指数显著小于播种40 d后的单作和伴生处理，表明大葱伴生显著减少了根际土壤细菌的数量，另外播种80 d后伴生处理的Simpson指数在所有处理中最低，表明伴生后期土壤细菌多样性增加。本次测序各样本文库的覆盖率均达98%以上，结果可以代表样本中微生物的真实情况。

表4 伴生处理根际土壤细菌的多样性指数分析Table 4 Analysis of microbial diversity index in the soil samples with differenTCoverinGTreatments

花瓣图主要用于统计多个样本中所共有和独有的可操作性分类单元(operational taxonanic units，OTU)数量。由图1可知，播种40 d后伴生处理和单作处理根际土壤中特有的细菌OUT数量是593、656，总OUT数量是3 724、3 787；播种80 d后伴生处理、单作处理特有的细菌OUT数量是432、454，总OUT数量是3 563、3 585。 共有的细菌OUT数量为3 131。

图1 细菌OTU分类水平花瓣图Fig.1 Diagram of Venn on OTU level of bacteria in different seedlings

2.3.2 根际土壤细菌OTU水平的主成分分析 图2是从测序结果中提取出主成分(最主要的元素和结构)，通过一系列特征值和特征向量排序进行的主坐标分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)。样品距离越接近，表示物种组成结构越相似。由图2可知，第一主成分对样品差异的贡献率为36.63%，第二主成分对样品差异的贡献率为24.51%。每个样品的群落结构相似度较高，样品倾向于聚集在一起，播种80 d后伴生处理的土壤样本与其他样本菌落组成结构差异最大，且其细菌菌落组成结构差异最小。因此，播种80 d后伴生处理对土壤细菌群落组成有显著正相关影响。

2.3.3 根际土壤细菌结构分析 图3展示了4个根际土壤样本中门水平细菌群落结构。结果表明，4个根际土壤样本中共有的主要细菌门有12个，其中变形菌门(Proteobacteria)占比最高，分别是33.07%、34.25%、32.31%、35.73%，而且播种40和80 d后单作处理土壤样本的变形菌门、未名菌门(unidentified_Bacteria)、酸杆菌门(Acidobacterio)相对丰度均大于10%，播种40和80 d后伴生处理土壤样本中只有变形菌门和未名菌门的相对丰度大于10%。

图2 细菌OTU水平下PCoA图Fig.2 The PCoA map of bacterial OTU level

图4展示了4个根际土壤样本中属水平细菌群落结构。结果表明，4个根际土壤样本中共有的主要细菌属有11个，包括鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、拉尔斯顿菌属(Ralstonia)、RB41、MND1、芽孢杆菌属(Bacillus)、芽单胞菌属(Gemmatimonas)、杆菌属(Bryobacter)、类固醇杆菌(Steroidobacter)、盖埃拉菌属(Gaiella)、黄杆菌属(Flavisolibacter)、哈良草菌属(Haliangium)，而且播种80 d后伴生处理的土壤样本中鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)的占比达到11.90%，高于其他3个土壤样本。

图3 细菌门分类水平结构分布图Fig.3 The bacterial structure distribution aTThe phylum level

图4 细菌属分类水平结构分布图Fig.4 The bacterial structure distribution aTThe genus level

2.3.4 根际土壤细菌菌落与土壤农化性质、土壤酶活性的相关关系 由图5可知，鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)与漆酶和脲酶活性呈显著正相关，与速效钾含量呈极显著负相关；拉尔斯顿菌属(Ralstonia)和速效钾含量呈显著正相关；RB41与漆酶、脲酶、蔗糖酶活性呈显著负相关；芽孢杆菌属(Bacillus)和速效钾含量呈极显著正相关；芽单胞菌属(Gemmatimonas)和速效钾含量呈极显著负相关、杆菌属(Bryobacter)与pH值、速效钾含量呈显著正相关；类固醇杆菌(Steroidobacter)和速效钾含量呈极显著正相关；盖埃拉菌属(Gaiella)和速效钾含量呈显著正相关。

注：AK：速效钾含量；AP：速效磷含量；AN：碱解氮含量；OM：有机质含量；L：漆酶活性；CAT：过氧化氢酶活性；ACP：酸性磷酸 酶活性；UE：脲酶活性；SC：蔗糖酶活性。Note: AK: Available K content. AP: Available P content. AN: Hydrolyzable N content. OM: Organic matter content. L: Laccase activity. CAT: Catalase activity. ACP: Acid phosphatase activity. UE: Urease activity. SC: Invertase activity.图5 根际土壤细菌群落与环境因子相关性Fig.5 Correlation heat map of soil bacterial community and environmental factors

3 讨论

与单作处理相比，伴生后根际土壤中有机质、碱解氮、速效钾含量均呈降低趋势，且随着伴生时间的延长，降低程度变缓，降低的原因可能是伴生大葱与甜瓜竞争养分，后期出现变缓趋势可能是通过伴生促进了土壤中原有养分的释放，使土壤中的养分达到平衡状态，这与赵晓翠[3]在甘蓝伴生黄瓜研究中的结论相似。另外，在本研究中，接种80 d后伴生处理土壤中脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶和漆酶活性总体显著高于单作，表明伴生栽培后显著提高了土壤酶活性，原因可能是通过伴生栽培造成了微生物互作，继而活化了根际微生物的生命活动，进而提高了土壤酶活性，改变了土壤的养分含量，这与孟亚利等[26]在棉麦共生研究中的结果大致相符。但关于根际土壤中各项理化指标和各类酶活性与植物体内的养分传送和转导、植物生理生化状况的具体关联还有待进一步研究。

土壤微生物群落结构多样性在维持生态系统功能上有着重要作用[27]。本研究结果表明，大葱伴生栽培后减少甜瓜根际土壤细菌数量，这与夏秀波等[28]在大葱伴生黄瓜上的研究结果相似；另外伴生栽培后增加了土壤细菌多样性，改变了甜瓜根际土壤细菌群落结构。在细菌门水平上，变形菌门占比最高，并且伴生处理变形菌门的相对丰度高于单作处理。Liu等[29]发现变形菌门与有机质含量呈显著或极显著正相关，这与本研究结果趋势大致相符，伴生栽培后期由于变形菌门丰度增加促进了土壤有机质含量的少量增加。酸杆菌门具有嗜酸性，其丰度受pH值影响[30]，土壤pH值降低有利于其生长[31]，因此伴生栽培后酸杆菌门丰度增加。在细菌属水平上，鞘脂单胞菌属为4个根际土壤样本的共同优势菌群。鞘脂单胞菌属是一类丰富的新型细菌资源，可用于芳香化合物的生物降解[32]，进一步研究表明该菌属在农业中也有广泛应用[33]，对有机磷、氨基甲酸酯、五氯苯酚和除虫菊酯[34]等三类农药具有较好的降解能力，同时对其他一些农药的降解也有良好效果[35]。鞘脂单胞菌属作为一种有益菌属，在解决甜瓜栽培地农药残留方面起到了积极作用。另有研究发现旱地中有机磷微生物主要是芽孢杆菌属[36]。本研究中伴生栽培后增加了芽孢杆菌属丰度，从而使根际土壤中速效磷含量提高，这与林启美等[37]研究结果相符。正是由于这些有益菌属的丰度增加改良了土壤生态环境。

通过对甜瓜测产得出伴生栽培后甜瓜单果重比单作栽培增加13.10%，推算得出亩产增加12.70%。这与前人研究结果一致，徐蕾[38]发现大葱套作白菜的白菜鲜重较单作增加了35.71%；夏秀波等[4]在大葱伴生番茄栽培试验中，大葱伴生番茄处理较番茄单作增产8.30%；李培颖等[39]在小麦伴生栽培黄瓜中，伴生处理产量比单作提高了4.7%。伴生处理后，甜瓜产量增加可以佐证大葱伴生栽培甜瓜模式是有效的、可供推广的栽培模式。

4 结论

本研究以大葱伴生栽培甜瓜后，对伴生栽培土壤的农化性质、土壤酶活性和高通量测序结果分析，得出伴生后土壤农化性质改变、土壤酶活性增加、土壤中有益菌丰度增加，进而增加甜瓜产量。接种80 d后大葱伴生栽培土壤的pH值、有机质含量高于单作，速效磷含量显著高于单作；脲酶、蔗糖酶、漆酶等土壤酶活性均显著高于单作；在门水平上变形菌门(Proteobacteria)等有益细菌门相对丰度增加；在属水平上鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)等有益菌属相对丰度增加；相关性分析表明，土壤细菌与土壤脲酶、土壤漆酶活性、pH值、速效钾含量有显著相关性。表明大葱伴生栽培甜瓜模式为解决甜瓜根际土壤的微生态环境恶化导致的大幅减产问题提供了参考。