华恢1号衍生系旱恢3T的选育及抗虫表现

叶水烽 楼 珏 高宁宁 杨 锌 邓接楼

(1 上饶师范学院生命科学学院，江西 上饶 334001；2 温州科技职业学院/温州市农业科学研究院 浙南作物育种重点实验室，浙江 温州 325006；3 上海市农业生物基因中心，上海 201106)

水稻(Oryzasativa)是我国最主要的粮食作物之一，对保障我国粮食安全发挥着重大作用。在生长过程中，水稻常会受到虫害的侵袭。其中，危害水稻的鳞翅目害虫主要有二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟。据报道，仅二化螟每年给农业生产造成高达70亿元的经济损失[1]。目前在农业生产中，对螟虫的防治主要依靠化学杀虫剂。杀虫剂虽然防治了虫害，但不可避免地增加了水稻生产成本，还造成了环境污染、农药残留等问题，长此以往，将对人类居住环境构成重大威胁。因此，培育抗虫品种是当务之急。然而，目前在水稻中尚未发现有效的抗螟虫的种质资源，无法通过传统的育种技术来解决抗性问题[2]。Bt基因是来源于苏云金芽孢杆菌的一种杀虫基因，其表达的蛋白产物可特异性毒杀不同的害虫，并且对人畜和环境无害。因此，应用转基因技术将Bt基因转入水稻，培育抗虫品种是目前最好的方法和选择。

1996年，Wünn等[3]报道了首例转Bt基因水稻，三年后，科学家们获得了第一例双价的Bt(cry1Ac+cry2A)水稻[4]。2000年，转Bt基因水稻的田间试验结果面世[5]。截至目前，已经有大量Bt转基因水稻的报道[6]，防治鳞翅目害虫使用较多的Bt基因主要有cry1Ab[7]、cry1Ac[8]、cry1Ab/Ac[5]、cry2AX1[9]，防治鞘翅目害虫的基因主要是cry3A[10]、cry30Fa1[11]。华中农业大学林拥军教授课题组通过密码子优化，获得了cry2A*[12]、cry1C*[13-15]等新型人工合成Bt基因，创制的转基因植株对二化螟、三化螟和稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫的抗虫效率均不低于95%。

近十多年来，以华中农大华恢1号(TT51)、T1C-19、T2A-1三个成熟转基因水稻材料为Bt基因供体，通过杂交、回交并结合分子标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)技术，利用PCR鉴定Bt基因或采用胶体金试纸对Bt蛋白进行检测，我国科学家先后选育出Bt5198[16]、Bt秀水134[17]、云抗虫稻1号、云抗虫稻2号、云抗虫稻3号等[18]抗虫水稻新材料。

农业生产过程中，水稻除了遭受虫害侵袭，还容易受到干旱胁迫[19]。节水抗旱稻作为新栽培稻品种类型[20-21]，是在水稻科技进步的基础上，引入旱稻的节水抗旱特性而育成的新品种，对发展节水型农业、缓解我国水资源危机具有重要意义[22-23]。华恢1号(TT51)是华中农业大学水稻团队研发的转cry1Ab/Ac基因抗虫水稻，转cry1Ab/Ac明恢63及其所配杂种Bt汕优63表现出了极高的抗虫性，并先后在2009年和2014年两次获得农业农村部颁发的农业转基因生物安全证书(生产应用)[24]。本研究以华恢1号(TT51)为cry1Ab/Ac基因供体，与节水抗旱稻恢复系旱恢3号杂交，经过4次回交，5次自交，通过农艺性状考察和田间自然感虫鉴定，获得高抗螟虫的新恢复系旱恢3T，以期为后续杂交转育培育抗虫抗旱新品种奠定材料基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

cry1Ab/Ac基因供体材料——华恢1号(TT51)水稻品种，由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室林拥军教授提供；节水抗旱稻恢复系品种旱恢3号、节水抗旱稻不育系品种沪旱5A，由上海市农业生物基因中心提供。

1.2 试验方法

1.2.1 旱恢3T的选育 以华恢1号(TT51)为cry1Ab/Ac基因供体，以节水抗旱稻恢复系旱恢3号为母本。在水稻抽穗开花期将母本颖花去雄，然后取TT51植株的花粉进行授粉，套袋至成熟收获。在每一代取农艺性状贴近旱恢3号的植株进行取样做Cry1Ab/Ac蛋白检测，选取阳性植株进行回交，4代后进行自交纯合，自交5代后将获得纯合抗性家系命名为旱恢3T。具体选育流程见图1：

图1 旱恢3T恢复系的选育流程Fig.1 Breeding restore line of Hanhui 3T

1.2.2 Cry1Ab/Ac蛋白的定性和定量检测 在转育过程中，取分蘖期新鲜叶片，加缓冲液碾磨出汁，取500 μL置于1.5 mL离心管，将Cry1Ab/Ac胶体金试纸条插入液体中，3～5 min后进行结果读取，有质控线和检测线双条线即为阳性植株。Bt蛋白的定量测定采用美国EnvironLogix公司的ELISA检测试剂盒(QualiplateTMkit for Cry1Ab/Cry1Ac)。样品的制备、酶联免疫反应及OD值的测定，均严格按照试剂盒使用说明书进行。

1.2.3 农艺性状考察 常规大田水肥、打药(防治螟虫)管理，旱恢3T和旱恢3号在每个小区种植6行，每行8株，共48个单株，3个重复，每个重复随机取10个单株，对株高、单株有效穗数、穗长、每穗粒数、结实率、千粒重及单株产量等农艺性状进行考察。

1.2.4 田间自然感虫条件下的抗虫性鉴定 在海南省陵水县光坡镇上海市农业科学院转基因基地内，对旱恢3T、旱恢3号、沪旱5A/旱恢3号、沪旱5A/旱恢3T进行常规水肥管理，但不防治螟虫，观察植株的卷叶和白穗情况。

1.2.5 数据统计与分析 试验数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，采用t测验法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 杂交选育过程的Bt蛋白定性检测

采用胶体金试纸法，快速、直接对杂交后代植株进行Cry1Ab/Ac蛋白检测，阴性植株只显示一条质控线，阳性植株同时显示质控线和检测线(图2)，每一代保留阳性植株进行回交及自交。

2.2 旱恢3T的Cry1Ab/Ac蛋白定量测定

在分蘖初期采用ELISA试剂盒，以父本TT51为对照，对旱恢3T的Cry1Ab/Ac蛋白进行测定。结果显示(图3)，在分蘖初期时，旱恢3T中叶片和茎秆中的Cry1Ab/Ac蛋白含量分别为16.54 μg·g-1FW和3.08 μg·g-1FW，TT51叶片和茎秆中的Cry1Ab/Ac蛋白含量为17.30 μg·g-1FW和3.53 μg·g-1FW，表明cry1Ab/Ac基因成功转入旱恢3号并正常表达，叶片中的表达量相对父本有所降低，具有显著差异，茎秆中的Bt蛋白表达量与父本无显著差异。

2.3 常规打药条件下的旱恢3T和母本旱恢3号的农艺性状比较

在常规打药条件下，旱恢3T和旱恢3号生育期没有改变，且在株高、单株有效穗数、穗长、每穗粒数、结实率、千粒重及单株产量都无显著差异(P>0.05，表1)，表明Bt蛋白的转入对旱恢3号的农艺性状无影响。

表1 旱恢3T和旱恢3号的主要农艺性状Table 1 Agronomic traits of Hanhui 3T and Hanhui No.3

注：左为阴性植株，只显示质控线；右为阳性植株， 同时显示质控线和检测线。Note: Left: Only one quality control line in negative plants. Right: Both quality control line and detection line in positive plants.图2 水稻植株Cry1Ab/Ac蛋白的阳性检测Fig.2 Positive detection of Cry1Ab/Ac protein in rice plant

注：*表示在P<0.05水平差异显著。Note: * indicates significant difference at 0.05 level.图3 旱恢3T植株和父本TT51植株叶片和茎秆的 Cry1Ab/Ac蛋白含量测定结果Fig.3 Determination of Cry1Ab/AC protein content in leaves and stems in Hanhui 3T plants and TT51 plants

2.4 田间自然感虫鉴定

在保证常规水肥管理，全生育期不打药的条件下，旱恢3T表现高抗旱稻纵卷叶螟，抽穗期前没有卷叶，成熟期未见白穗；对照旱恢3号在抽穗期前则有明显的卷叶螟为害症状，叶片卷成筒状，内有白丝及长短不一的条状白斑，在成熟期41.5%的植株有白穗出现(图4)。此外，在相同的管理条件下，以沪旱5A为母本，分别以旱恢3T和旱恢3号作父本，制得的杂种在田间抗性表现与父本一致，即沪旱5A/旱恢3号受卷叶螟危害，沪旱5A/旱恢3T高抗卷叶螟(图5)。

3 讨论

为实现我国农业绿色和可持续发展的要求，以既有水稻高产特性，又有旱稻节水抗旱特性的节水抗旱稻品种为基础材料，进行抗虫性状改良，培育“少打农药、少施化肥、节水抗旱、优质高产”的绿色超级稻，具有重要意义[25-27]。目前，尚未发现能抗鳞翅目害虫的水稻种质资源，传统杂交育种很难培育出抗螟虫水稻。因此，利用转基因技术将苏云金芽孢杆菌的Bt基因转入水稻，培育抗螟虫的水稻材料，是最可行的途径。我国科学家已经获得了大量转Bt基因抗虫水稻材料[28-30]，华恢1号(TT51)两次获得农业农村部颁布的农业转基因生物安全证书(生产应用)[24]，是理想的高抗螟虫的Bt基因供体材料。

图5 杂交种在田间的抗虫性表现Fig.5 Insect resistance of hybrids under field

在材料转育过程中，高效鉴定出目的基因非常重要。一般来说，PCR技术使用最广，但偶尔会出现假阳性、假阴性结果。本研究采用商业化Cry1Ab/Ac胶体金检测试纸条定性检测目标蛋白，在田间缺少必要的实验仪器时，可简单、快速地进行样品鉴定，而且Bt蛋白为外源蛋白，不受水稻本体蛋白污染，准确率高。同时，在回交过程中，挑选与轮回亲本长势相似的单株进行试验，可加快背景基因的纯合。试纸条检测结果为阳性的植株在田间不发生卷叶。

将外源基因导入水稻中，其是否表达及能否稳定遗传是值得关注的问题。本研究利用旱恢3T为恢复系与不育系沪旱5A进行配组，获得的沪旱5A/旱恢3T杂交种表现高抗螟虫，显示cry1Ab/Ac基因能够稳定遗传并高效表达，与前人的研究结果一致[31]。

4 结论

本研究以华恢1号(TT51)为供体，对节水抗旱稻恢复系旱恢3号进行改良，获得对稻纵卷叶螟具有高度抗性的水稻恢复系旱恢3T，其基本农艺性状与轮回亲本旱恢3号无显著差异，可直接用于抗虫杂交稻组合的配制，为水稻抗性育种奠定了材料基础。利用杂交选育改良优良亲本，不仅要提高改良材料的抗性，而且要保持轮回亲本优良的农艺性状。后期可利用全基因组芯片进行背景选择，提高准确度和精确度，加速水稻品种改良。