基因工程改造大肠杆菌生产酪氨酸探究

程 岑

(淮南联合大学人文与外国语学院， 安徽 淮南 232001)

目前，利用不同的代谢方式来产L-苯丙氨酸和L-色氨酸产品很多，但很少投资于研究L-酪氨酸产物的发酵,因此希望通过对高产量苯丙氨酸菌株改造得到酪氨酸产量明显提高的改造菌株。利用Red同源重组技术敲除pheL、pheA基因可阻断分支酸到L-phe的生化反应，促进酪氨酸在大肠杆菌体内积累。大肠杆菌pheA基因缺陷株的研究在国外已取得进展，但国内没有报道。Monica M. Olson等人通过敲除pheA基因(编码分支酸变位酶/预苯酸脱水酶)和其前导序列pheL，将生产苯丙氨酸的大肠杆菌K12菌株改造成酪氨酸，并在tyrA前加上强启动子trc启动子，使得酪氨酸对葡萄糖的转化率达到9 %。Ranjan Patnaik等人通过优化发酵条件使酪氨酸的产量达到55g/l，对葡萄糖的转化率达到0.3(g/g)，是目前发酵罐培养的最高产量。

一、材料与方法

(一) 实验材料

1.菌株与质粒。Escherichia coli K12、KF；质粒pKD46，质粒pCRP(提供氯霉素抗性基因)，质粒pMD19-T Simple Vector(克隆载体，用于PCR产物TA克隆)，质粒pEVC(含λ噬菌体PL和PR启动子)，质粒pEVC-GF(具有含有酪氨酸代谢途径关键酶基因aroG基因，含λ噬菌体PL和PR启动子)，质粒pEVC-GA(具有含有酪氨酸代谢途径关键酶基因aroG、tyrA基因)。其中pMD19-T Simple Vector购自宝生物工程(大连)有限公司，其他菌株与质粒由本实验室保存。

2.主要试剂。EcoRI、BglII、SphI等限制性内切酶，λ-EcoT14I digest、DL 2000等DNA Marker，细菌基因组提取及DNA胶回收试剂盒，Taq、Taq-plus、Pfu等DNA聚合酶以及其他市售分析纯化学试剂。

3.培养基。LB培养基 (pH 7.0)、发酵MG培养基(pH值7.0)、MG培养基(pH值7.0)。

(二) 方法

1.打靶PCR片段制备。将含有氯霉素抗性基因的质粒pCRP经酶切线性化后作为模板，扩增用于打靶的抗性基因片段，PCR产物切胶回收，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化，最后用无菌超纯水洗脱溶解。

2.电转化。将相应拟敲除基因大肠杆菌E.coli k12(含质粒pKD46)接种于3 ml LB培养基(含氨苄青霉素)中，30 ℃培养过夜；过夜菌液以0.5 %比例接种于50 mL LB培养基中，在30 ℃于200 r/m培养至OD600约为0.2；加L-阿拉伯糖到达终浓度30 mmol/L，37 ℃200 r/m升温诱导培养1 h；上述50 mL菌液冰中放置10 min后，4 ℃ 12 000 r/min离心2 min收集其菌体；再用50 mL冰冷的超纯水重悬洗涤，于4 ℃10 000 r/min离心2 min收集菌体，重复此步骤3次，最后用300 mL无菌水重悬；取上述菌体细胞50 μL，与一定浓度制备好的PCR产物混匀，冰上放置2 min后加入电击杯进行电击，电击后立即加入1 mL LB培养基，37 ℃200 r/min振荡培养1 h 30 min；取150 μL涂布于含有相应抗性的LB平板上，37 ℃培养约20 h。

3.敲除菌株的鉴定与筛选。将PCR鉴定正确的重组菌株接种于3 mlLB液体培养基(含氯霉素抗性)中，42 ℃过夜培养后，稀释菌液涂布无抗平板获得单克隆菌落。质粒pKD46为氨苄青霉素抗性而敲除菌株应具有相应其他筛选抗性，对分离得到的单菌落分别进行氨苄青霉素和相应筛选抗性的抗性检测，筛选出对氨苄青霉素敏感而对相应筛选抗性不敏感的单克隆，即为pKD46消除的敲除菌株。

4.目标基因的克隆和重组质粒构建。采用基因组DNA提取试剂盒提取大肠杆菌DH5α基因组DNA，以此为模板进行PCR，扩增tyrA基因，将PCR克隆得到的基因与T载体连接，所用T载体为Takara公司的pMD19-T Simple Vector，得到重组质粒。

5.目的基因与质粒的连接及酶切鉴定。用限制性内切酶对目的片段及表达载体进行双酶切，分别切胶回收目的基因DNA片段和线性化的质粒，纯化后进行粘端连接，连接产物转化感受态DH5α，筛选阳性克隆。

6.菌体浓度的测定。对摇瓶培养的菌液，每隔2 h取一次菌样，将待测菌液用去离子水稀释至适当浓度，用722 s可见分光光度计测量600 nm波长处的吸光度。以时间(h)为横坐标，OD600为纵坐标制作菌体生长曲线。

7.分析方法。葡萄糖含量测定用DNS法(3,5-二硝基水杨酸比色法)；酪氨酸含量测定用高相液相色谱；普析通用L6高效液相色谱系统；普析通用紫外检测器；Diamonsil 5 μm C18 色谱柱(250×4.6 mm)；流动相为甲醇-0.25 mmol/L NaH2PO4水溶液(pH3.0，1∶99，v/v)；流速1 mL/min；检测波长205 nm。

二、结果与讨论

(一) 改造大肠杆菌菌株的生长状况

改造后大肠杆菌菌株的生长曲线如图1所示。由图1可知，E.coli K12(tyrA- pheA- pGA1)、E.coli K12(tyrA- pheA- pGA2)、E.coli KF(tyrA- pheA- pGA1)、E.coli KF(tyrA- pheA- pGA2)，基因改造各菌株生长速度差别明显，说明aroG及tyrA的表达在此条件下对菌株的生长速度有明显影响；E.coli K12(tyrA- pheA- pGA1)、E.coli KF(tyrA- pheA- pGA1)比E.coli K12(tyrA- pheA- pGA2)和E.coli KF(tyrA- pheA- pGA2)生长状况好，说明tyrA基因第357位点的突变对菌株生长速度可能有一定的影响。

(二) 改造大肠杆菌菌株对葡萄糖的利用情况

菌体对葡萄糖的吸收能力对菌体生长有至关重要的影响，生长过程中培养基葡萄糖浓度变化如图2所示。从图2中可看到，E.coli K12(tyrA- pheA- pGA1)、E.coli K12(tyrA- pheA- pGA2)、E.coli KF(tyrA- pheA- pGA1)、E.coli KF(tyrA- pheA- pGA2)对葡萄糖的利用情况基本相同，最终的葡萄糖消耗量也是基本相等的，基本上24 h消耗殆尽，其中相比E.coli K12(tyrA- pheA- pGA2)葡萄糖的剩余量多一些。

图1 大肠杆菌酪氨酸代谢途径改造

图2 大肠杆菌基因改造缺陷菌株

(三) 改造大肠杆菌菌株摇瓶发酵结果

将表达酪氨酸代谢途径关键酶基因aroG和tyrAfbr及aroG和tyrAWT的质粒pGA1、pGA2分别转化入E.coli K12和KF中，其均含λ噬菌体PR启动子，故采用39 ℃诱导表达，在补加葡萄糖浓度为2 g/L的MG培养基中摇瓶培养结果如图3所示。由图3可知，四个敲除菌株都有一定酪氨酸产量积累，代谢途径改造有利于酪氨酸的合成，表明基因aroG克隆表达促进了E4P和PEP合成DAHP，使碳硫更多地流入莽草酸途径及芳香族氨基酸合成途径，而tyrA的克隆表达进一步促进了代谢流更多的流向酪氨酸途径，从而使酪氨酸在原有菌株基础上得到更大的积累。但大肠杆菌K12敲除菌株酪氨酸产量与KF菌株相比差别很大，K12改造菌株产酪氨酸的量明显高于KF，大概是KF菌株的2倍，这与理论推断不符，有待于进一步研究。在第24小时Tyr对葡萄糖的转化率(g/g)见表1。

图3 大肠杆菌酪氨酸基因改造菌株对酪氨酸生产的影响

表1 Tyr对葡萄糖的转化率

三、结论

通过Red同源重组系统，利用含有氯霉素抗性基因和目标基因同源臂的打靶片段，成功敲除了酪氨酸代谢途径的的关键酶基因pheL和pheA，在已有菌株E.coli K12和E.coli KF的基础上，进一步得到E.coli K12 pheL- pheA-菌株和E.coli KF pheL- pheA-菌株。通过PCR方法克隆得到DAHP合成酶的基因aroG和编码分支酸酶/预苯酸脱氢酶的tyrA基因，将其构建进入质粒pEVC，得到表达载体pEVC-aroG-tyrA(简称pGA)，将pGA分别转化进入上述得到的E.coli K12 pheL- pheA-菌株和E.coli KF pheL- pheA-菌株中，使酪氨酸产量得到提高。在以补加葡萄糖为碳源的MG培养基中，四个菌株的生长状况差别较大，其中含pGA1质粒的菌株比含pGA2质粒的菌株生长状况好。四个菌株葡萄糖的利用情况基本相同。利用得到的E.coli K12(tyrA- pheA- pGA)菌株生产酪氨酸，酪氨酸产量明显高于E.coli KF(tyrA- pheA- pGA)菌株，约为E.coli KF(tyrA- pheA- pGA)菌株的2倍，E.coli K12菌株可更好地用于酪氨酸的发酵生产，在此基础上，对酪氨酸代谢途径上游关键基因进行更合理的改造，有望实现酪氨酸的低成本工业生产。