北苍术种子DNA条形码研究及序列特征分析

谢红波，赵 晴，穆威杉，史萌萌，石林春，刘金欣*，赵春颖*，李云峰

（1.承德医学院 河北省中药研究与开发重点实验室，河北承德 067000； 2.中国医学科学院＆北京协和医学院 药用植物研究所）

苍术，为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea（Thunb.）DC.或北苍术Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.的干燥根茎，具有健脾燥湿、祛风散寒、明目的功效[1,2]。自2003年“非典”事件之后，苍术市场需求量逐年上涨，野生资源日益枯竭，市场供需矛盾尖锐，急需扩大苍术商品生产规模[3-6]。然而，苍术自然状态下的结实率远低于关苍术Atractylodes japonica Koidz.和白术Atractylodes macrocephala Koidz.[5]。同时，部分地区常将关苍术和朝鲜苍术Atractylodes koreana (Nakai) Kitam.混作北苍术用于入药[7]，造成了苍术种子市场存在种源混乱、种质混杂现象的主要原因。种子作为中药材生产的源头，保证其基原的准确性显得尤为重要。DNA条形码技术是通过利用不同生物基因组中一段通用的、具有差异特征的DNA片段来进行物种鉴定，可以不受外界环境影响及经验的限制，具有客观、准确等特点，其历经20余年的发展，已经广泛应用于植物类及动物类中药材鉴定领域[8-10]。与中药材相比，应用DNA条形码技术对中药材种子鉴定研究主要面临以下问题[11,12]：（1）中药材种子大小不一，微小种子的DNA难以提取；（2）种子通常含有大量的油脂或淀粉类物质，抑制PCR的扩增效率；（3）对于异花授粉植物，种子多为双亲遗传的杂交体，杂交对测序质量的影响尚需验证。本研究尝试基于ITS2和psbA-trnH序列对北苍术种子进行鉴定研究及序列特征分析，探讨北苍术种子DNA条形码技术鉴定的可行性，以期为保障北苍术种子基原的准确鉴定提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 仪器设备

SQP型电子天平（德国Sartorius公司），MM400型球磨仪（德国Retsch公司），T100型聚合酶链式反应（PCR）扩增仪（美国Bio-Rad公司），NanoDropTM One型超微量分光光度计（美国Thermo Scientific公司），DYY-6C型电泳仪（北京六一生物科技有限公司），ChemiDocTMXRS+型凝胶成像仪（美国Bio-Rad公司），SZX16型高级研究体视显微镜（日本Olympus公司），植物基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.2 样品收集

从苍术种植基地和市场收集北苍术种子12份，包括河北省承德市、张家口市、保定市以及辽宁省、甘肃省等地区，种子经承德医学院赵春颖教授鉴定（表1）。所有样品存放于承德医学院中药研究所（河北省中药研究与开发重点实验室）。

表1 种子样品的采集信息

1.3 种子的形态学观察

随机挑取北苍术种子20粒，利用体视显微镜观察种子的外观形态特征（形状、大小、颜色、表面纹理等），使用数显游标卡尺（上海史丹利五金工具有限公司）测量种子的长度和宽度。参照《农作物种子检测规程》GB/T3543.7-1995，采用百粒法测定种子的千粒重。

1.4 DNA提取、PCR扩增及测序

随机挑选颗粒饱满的种子1粒，用75%酒精棉对种子表面进行消毒，称重后研磨。剩余步骤参照植物基因组DNA提取试剂盒产品说明书提取种子的总DNA，并调整其水浴条件为56℃，水浴8~12 h或过夜。ITS2序列和psbA-trnH序列的扩增引物、PCR扩增体系和扩增程序参照“中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”[9]。PCR产物经纯化后使用ABI 3730XL型测序仪进行双向测序。

1.5 数据分析

使用超微量分光光度计测定种子DNA的浓度和纯度，对其质量进行评价；采用琼脂糖凝胶电泳法对PCR产物进行检测，并计算其PCR扩增成功率；利用CodonCode Aligner V9.0.1对测序峰图进行质量评估、预处理及序列拼接。基于隐马尔可夫模型（hidden markov model，HMM）对获得的ITS2序列进行注释[13]。psbA-trnH序列根据GenBank数据库上的参考序列进行处理，其中，psbA的保守区序列为CGAAGCTCCATCTACAAATGGATAA，trnH的保守区序列为GGCGGATGTAGCCAAGTGGATCAAG。利用MEGA-X进行多序列比对和序列特征分析[14]。

2 结果与分析

2.1 北苍术种子形态特征

北苍术种子为瘦果，倒卵圆形或长椭圆形，偶有弯曲，长5.33~7.91mm，宽1.87~3.28mm；表面褐色，有不规则条纹状纵沟，密被白色长直毛，有时稀疏，顺向贴服；顶端有羽毛状冠毛，黄褐色，易脱落；基部呈环状，萌发时胚根由此突破种子；胚直立，具有2片子叶，肉质，无胚乳。北苍术种子的千粒重约为14.01g。北苍术种子外观形态特征如图1。

图1 北苍术种子的外观形态特征

2.2 DNA提取结果及PCR扩增成功率

北苍术单粒种子的重量在13.87~26.35 mg之间，根据赵晴等[11]提出的“中药材种子DNA条形码分子鉴定原则”，采用单粒取样的方式。DNA提取结果显示，北苍术种子样品的DNA浓度均在148.4~418.4ng/μL范围内，平均值为268.89ng/μL，其在260nm和280nm处的吸光度比值A260nm/A280nm处于2.0~2.1之间，表明所提取的种子DNA质量良好，均可满足后续PCR扩增要求（表2）。使用ITS2和psbA-trnH通用引物对所获得的种子DNA进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳法检测后发现，所有种子样品的PCR产物均可检测到1条清晰、明亮的条带，PCR扩增成功率为100%（图2）。

表2 北苍术种子的DNA提取质量

图2 北苍术种子的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图

2.3 DNA测序及序列质量分析

去除低质量区域和引物序列后，ITS2单向测序的Contig information显示碱基质量Q（quality value）≥20的比例为99.1%，且经双向测序拼接后均可获得高质量的测序结果，拼接结果长度均＞225 bp，其Contig information显示Q30的碱基数量占比99.6%（图3）；尽管获得的psbA-trnH序列由于串联重复序列单元（poly A/T），导致部分序列测序时发生信号减弱的现象，但其单向测序结果的Contig information显示Q20的碱基数量比例高达98.2%；经双向测序拼接后的序列长度均＞385 bp，且Contig information显示Q30的碱基数量占比98.2%，序列质量良好（图4）。

图3 北苍术种子样品HSZZ2894_2F的ITS2序列峰图

图4 北苍术种子样品HSZZ2894_PA的psbA-trnH序列峰图

2.4 北苍术种子DNA条形码序列特征分析

共获得北苍术种子DNA条形码序列24条，包括12条ITS2序列和12条psbA-trnH序列。其中ITS2的序列长度为228~230 bp，比对后长度230 bp，GC含量在68.7%~69.3%之间，平均值为68.02%；获得的12条ITS2序列除220和223位点存在插入/缺失外，尚无发现变异位点，序列特征（图5）。

图5 北苍术种子ITS2序列的序列特征

12条北苍术种子的psbA-trnH序列长度为389~398 bp，比对后序列长度为401 bp，GC含量在23.8%~24.3%之间，平均值为24.05%；含有3个变异位点，分别为32、77位点的A-G变异，86位点的C-A变异；在50、154、340、365位点分别存在一个插入/缺失位点，在233~238位点存在一个6 bp的插入/缺失区域；12条psbA-trnH序列分为4个单倍型，H1为主导单倍型，包含9条序列，H2、H3和H4单倍型各包含1条序列，其主导单倍型序列特征（图6）。

图6 北苍术种子psbA-trnH序列主导单倍型H1的序列特征

3 讨论

3.1 DNA条形码技术可以用于中药材北苍术种子的鉴定

北苍术种子含有丰富的油脂类成分[15]，在研磨时容易被氧化，影响DNA的提取质量和浓度[9]。本研究在DNA提取过程中，采用单粒取样的方式，可以有效避免不同北苍术种子之间遗传物质的相互干扰。分别使用酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)和氯仿/异戊醇（24:1）进行抽提，加入与上清液等体积的-20℃预冷的异丙醇进行DNA沉淀，所有样品均可获得高质量的北苍术种子DNA，满足后续PCR扩增需求。采用琼脂糖凝胶电泳法对获得的PCR产物进行检测，发现所有种子样品的PCR产物均可检测到1条清晰、明亮的条带，PCR扩增成功率为100%。尽管部分种子样品由于插入/缺失以及poly结构导致单向序列的测序质量较低，但双向拼接后皆可获得较高质量的测序结果。对北苍术种子的ITS2和psbA-trnH序列特征分析表明，不同产地、不同批次的北苍术种子种内变异较小，遗传稳定性好。由此可见，基于DNA条形码技术可以稳定获得北苍术种子的ITS2和psbA-trnH序列，利用DNA条形码技术对北苍术种子的基原物种进行鉴定分析具有一定的可行性。

3.2 DNA条形码技术有利于推进苍术种子标准化

当前，我国中药材种子种苗尚缺乏系统的质量管理体系，现有的中药材种子种苗相关标准中仅有少部分品种如人参、三七等是专门针对中药材而制定的，大部分归属于农业和林业，涉及的中药材不足《中国药典》收载的20%，有待进一步完善[16]。种子种苗是中药材生产的物质基础，保障中药材种子种苗的真实性是中药材安全生产的首要条件和重要前提[17]。然而，传统的中药材种子真伪鉴定往往依靠种子的形态特征和显微特征进行，对检测人员的专业知识和经验具有较高的要求，特别是对于同属植物或细小类种子的鉴定存在一定困难[12,17]。相对于其他传统及分子鉴定方法，DNA条形码技术具有三大明显优势：鉴定结果可重复性良好，方法通用性强，可构建统一数据库和鉴定平台，易于推广和标准化[18]。刘金欣等[19]基于构建的黄芩DNA条形码数据库对市售黄芩种子进行鉴定，表明基于ITS2序列可用于黄芩种子的物种鉴定。石林春等[12]通过对51份知母种子进行鉴定研究，建议psbA-trnH作为知母种子鉴定的DNA条形码序列，可用于知母种子的真实性鉴定。本研究利用ITS2和psbA-trnH序列对北苍术种子进行鉴定研究及序列特征分析，进一步证明DNA条形码技术可以有效应用于中药材种子的鉴定，有利于实现对中药材种子的数字化监管，推进中药材种子标准化工程，对于中药现代化具有重要的意义。