P-选择素mRNA及蛋白在良、恶性葡萄胎鉴别诊断中的临床意义

李佳欣，石晓虹，齐洁敏

（承德医学院病理教研室，河北承德 067000）

葡萄胎（hydatidiform mole，HM）是女性生殖系统常见的滋养层细胞疾病，有良性葡萄胎和恶性葡萄胎之分，多见于育龄期妇女。目前组织病理学诊断是临床上主要的诊断方法，但是有些病人在发生转移后才能确诊，给临床及时诊断带来困难。恶性葡萄胎发展的关键因素之一是细胞的侵袭、转移，而单一病理学诊断缺乏鉴别良、恶性葡萄胎的可靠指标，研究其表达变化可能对临床鉴别诊断良、恶性葡萄胎有意义。因此本实验选择与肿瘤侵袭、转移相关指标P-选择素，联合采用qRT-PCR技术、免疫组化SP法及Western Blot技术，在基因及蛋白水平上分析其在良、恶性葡萄胎组织中的表达，综合分析不同点，为临床大夫早期鉴别诊断以及精准治疗提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 临床资料

收集河北省承德市医院、承德市妇幼保健院、承德医学院附属医院和秦皇岛市第一医院2016年6月～2019年10月经手术切除的良性葡萄胎组织标本50例，恶性葡萄胎组织标本22例（术后病理已证实为恶性葡萄胎），所有病例临床病理资料齐全。

1.2 组织标本的处理

将组织标本分为两部分，一部分固定在10%中性甲醛液中，之后进行常规脱水、透明、石蜡包埋、切片等步骤，用于免疫组化实验检测。另一部分新鲜组织存放于液氮罐中，提取组织mRNA和蛋白以进行qRT-PCR和Western Blot实验。

1.3 试剂

IgG羊抗兔二抗（KPL公司）；β-actin抗体（Bioworld生物公司）；蛋白Marker（Thermo公司）；免疫组化试剂盒（中杉金桥公司）；转录、qRT-PCR试剂盒（北京天根生化科技公司）；大连宝生物公司设计合成内参基因和目的基因引物，引物序列如表1。

表1 引物序列

1.4 方法

1.4.1 qRT-PCR技术 向新鲜组织标本中加入适量Trizol，用组织研磨仪对其进行充分研磨，然后离心提取组织中的总RNA，操作全程注意低温无酶，最后测定RNA浓度。参照试剂盒将RNA反转录为稳定的cDNA后，进行qRTPCR反应检测P-选择素 mRNA的表达。将引物、模板等依次加入八连排管中后，放入qRT-PCR仪中，参照说明书设置反应程序：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，共40个循环，其中所有样本设置3个副孔，并重复3次实验。采用2-△△Ct相对定量法表示mRNA的相对表达量。

1.4.2 免疫组化SP法检测 标本制成蜡块后进行切片，参照试剂盒说明书步骤染色，当恶性葡萄胎细胞的胞质中出现棕黄色颗粒判定为P-选择素阳性表达。每张切片随机选择10个高倍视野进行双盲判定。最后依据P-选择素染色强度及阳性细胞数联合判定结果。（1）染色强度评分：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。（2）阳性细胞百分比评分：＜5%为0分，5%~25%为1分，25~50%为2分，≥50%为3分，上述两项评分结果相乘，若得分0~1分为，2~3分为+，4~6分为++，＞6分为+++[1]。

1.4.3 Western Blot技术检测 称取约100mg新鲜的良、恶性葡萄胎组织置于匀浆器中，加入1ml裂解液研磨，待静置裂解后离心，取上清于新的EP管中，测定总蛋白浓度后进行加热变性处理。40μg蛋白上样量，经电泳、转膜、封闭2h后加入一抗，P-选择素抗体浓度为1:500，β-actin抗体浓度为1:3000，4℃孵育过夜。第二天，摇床复温1h，TBST洗膜后，二抗浓度1:10000孵育50min，最后采用ECL化学发光法发光并采集图像。条带灰度值用Image-J软件分析，目的蛋白条带灰度值比内参蛋白条带灰度值，即为目的蛋白相对表达量。

1.5 统计学分析

2 实验结果

2.1 P-选择素mRNA的表达情况

与良性葡萄胎组织相比（6.81±0.20），恶性葡萄胎组织（8.63±0.41）P-选择素mRNA的表达明显增多（t=13.43，P＜0.05，见图1）。

图1 P-选择素mRNA在良、恶性葡萄胎组织中的表达

2.2 P-选择素蛋白的表达情况

2.2.1 免疫组化结果 P-选择素蛋白的阳性表达主要定位于良、恶性葡萄胎组织滋养层细胞中的细胞质（如图2）。与良性葡萄胎组织相比，恶性葡萄胎组织中P-选择素蛋白的阳性表达率及阳性表达强度显著高于良性葡萄胎组织（P＜0.05），见表2。

表2 P-选择素蛋白在良、恶性葡萄胎组织中的表达情况

图2 免疫组化SP法检测P-选择素蛋白的表达

2.2.2 Western Blot 技术检测结果显示 与良性葡萄胎组织相比（0.55±0.04），恶性葡萄胎组织（1.02±0.06）P-选择素蛋白表达较良性葡萄胎组织增强（t=24.53，P＜0.05，图3），这与免疫组化结果互相吻合，在蛋白水平上起到相互验证的作用，结果更准确。

图3 P-选择素蛋白良、恶性葡萄胎在的表达

3 讨论

选择素是粘附因子中一个重要的大家族[2]，包括E-选择素、L-选择素和P-选择素，其中,P-选择素主要参与炎症和动脉粥样硬化以及血栓形成等病理过程。Qi等[3]发现P-选择素通过介导血小板的粘附促进肿瘤的生长。周俊超等[4]采用免疫组化及PCR法检测脑膜瘤组织中P-选择素表达情况，发现与对照组同期健康体检者相比，P-选择素表达水平显著升高，认为P-选择素可以作为脑膜瘤侵袭性判定的参考指标。冯莲[5]在大肠癌研究中发现P-选择素表达升高，认为P-选择素参与了大肠癌的发生和发展过程，可作为大肠癌临床防治的新方向，这与Korniluk等[6]的研究结果一致。Nasti等[7]在P-选择素基因敲除的小鼠体内接种乳腺癌细胞，与野生型小鼠相比，缺乏P-选择素的小鼠存活率更高，抑制P-选择素对乳腺癌的生长和转移具有重要的治疗意义。在黑色素瘤的研究中发现,P-选择素可介导血小板黏附，促进黑色素瘤细胞转移[8]，进而建立小鼠黑色素瘤肺转移瘤模型将P-选择素敲除，发现P-选择素的缺失抑制了黑色素瘤的肺转移[9]。Rip1-Tag2小鼠胰岛β细胞瘤中对P-选择素进行了敲除，同样也发现P-选择素缺失可抑制Rip1-Tag2小鼠胰岛β细胞瘤侵袭和转移[10]。郭杏丹等[11]发现，P-选择素在卵巢癌组织中高表达，其蛋白阳性表达的患者3年生存率低于阴性表达患者，这种高表达状态对患者预后不利。刘夏炎等[12]研究发现，甲状腺癌患者的预后与外周血P-选择素的表达具有相关性。王闯等[13]研究发现，P-选择素参与了宫颈鳞癌的发生、发展，尤其是浸润、转移的过程。在胃癌中，有淋巴结转移者P-选择素阳性表达率增高，且P-选择素阳性表达者5年生存率明也显著低于阴性表达者，这表明P-选择素阳性表达的胃癌易发生侵袭、转移并且预后差[14]。在非小细胞癌[15]、子宫内膜癌[16]、喉癌[17]的研究中均可发现P-选择素的表达升高，参与肿瘤发生发展过程。侵袭、转移不可缺少环节就是恶性肿瘤细胞与内皮细胞、血小板等粘附，P-选择素作为粘附因子通过介导恶性肿瘤细胞与血小板发生黏附对肿瘤的发生、侵袭及转移起到促进作用[7]，因此抑制P-选择素表达就有可能降低肿瘤细胞与血小板与黏附力，达到抑制肿瘤转移目的。

国内外文献研究对P-选择素在良、恶性葡萄胎组织中的表达存在空缺。本实验从基因和蛋白水平全面检测粘附因子P-选择素在良、恶性葡萄胎组织中的表达情况，发现恶性葡萄胎组织P-选择素mRNA、蛋白表达水平与良性葡萄胎相比较均有升高（P＜0.05），说明P-选择素在蛋白水平和基因水平上都参与了葡萄胎的发生、发展。在良性葡萄胎转变成恶性葡萄胎过程中，存在着P-选择素mRNA和蛋白表达从低表达量到高表达量的变化过程，当其表达量累积到一定程度会发生质变，其转化机制需要更深一步研究。

从病理学角度看，葡萄胎的侵袭性、转移性可作为良、恶性葡萄胎的区别点，如果能够找出葡萄胎侵袭、转移性的标志物，可利用子宫内膜组织刮出的标本进行良、恶性葡萄胎的鉴别诊断。我们用三种方法在基因及蛋白水平上检测并进行综合分析，每种试验方法结果是一致的，故而最后得出的结论可靠性、准确性更大。大部分恶性葡萄胎患者采用放化疗手段而不进行手术，恶性葡萄胎标本收集难，病例数较少，日后随着收集的样本数量增多，可做深层次研究为早期发现葡萄胎恶变可提供新线索。