发酵鱼中菌群组成及发酵特性研究进展

孙海鑫，陈智慧，王盛美，韩 军，孙纪录,

（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定 071000；2.云南省曲靖农业学校生物技术学部，云南曲靖 655000；3.河北农业大学现代科技学院，河北保定 071000）

鱼类食品被认为是人类食物资源中不可或缺的一部分，不同鱼类的各种加工食用方式在悠久的历史中不断演化改进。发酵是鱼类产品加工手段中极其重要的加工方式[1]，起初是作为鱼肉保鲜的手段出现的[2]。随着鱼类产品的消费量不断增加，发酵方法得以不断改进[3]。世界各地的发酵鱼种类丰富多样，历史悠久，是一种传统的特色美食[4]。发酵也从保藏手段逐渐变为加工手段。因地理位置差异，世界各地的发酵鱼有不同类型的加工制品（见图1），风味也因此迥异富有特色[5−6]。例如，在印度尼西亚地区的盐渍发酵鱼Jambal roti和Budu[7]；瑞典地区的即食酸鲱鱼产品Surströmming[8]；柬埔寨地区的发酵鱼制品Prohok[9]；冰岛地区的腌制鲨鱼肉Hákarl[10]；亚洲是发酵鱼的主要市场，尤其是在中国，发酵鱼类型有贵州和湖南地区的酸鱼、安徽地区的臭鳜鱼、广东地区的糟鱼、潮汕地区的鱼露、海南地区的鱼茶等各种发酵制品[11]。发酵鱼具有营养价值高、地域风味强、制备条件简易等特点，诸多研究均展现出发酵鱼是人体蛋白质、矿物质、微量元素的重要来源，其营养对人体健康和膳食均衡起到一定影响[6]。例如，Siscovick等[12]的研究中发现鱼油对预防糖尿病、心脑血管疾病和中风的优势。Najafian等[13]从发酵鱼中分离出的抗氧化活性肽用作功能性食品成分和药物时可预防疾病，增强人体体质。

图1 发酵鱼分类Fig.1 Classification of fermented fish

鱼肉发酵的关键是微生物和酶，对发酵鱼中的微生物菌群和功能性菌的研究有利于制备优良发酵剂提高发酵鱼产量和品质，缩短发酵时间，提高工业化生产的稳定性[14−15]。在发酵过程中，各种微生物相互作用将发酵原料中的各种大分子物质代谢分解成易被身体消化吸收的小分子活性物质[16]，从而使得发酵成品的发酵时间、质地、风味、营养含量、香气成分等均发生显著变化[17−20]，一些微生物的发酵产物还能起到调节免疫系统[21]、预防某些疾病的作用[13]。目前人们对很多类型发酵鱼产品中的微生物菌群组成尚未有太多了解，因此对发酵鱼食品中的微生物菌群及其在发酵过程中的功能特性进行研究对发酵鱼产业发展和产品质量提高都具有重要意义。对发酵鱼食品微生物组成和发酵特性进行综述，为发酵鱼领域发展提供理论资料。

1 发酵鱼中的微生物

发酵鱼的核心词是发酵，发酵离不开微生物的代谢活动，不同地区因环境和发酵原料的差异导致发酵鱼中的微生物有很大差异。不同的优势菌种因代谢差异导致了各种类型的发酵鱼之间风味、质地、色泽、安全性差异显著[22]。发酵鱼中有两类主要的微生物，一部分是有益微生物，包括乳酸菌、微球菌、酵母菌、葡萄球菌，另一部分主要是有害微生物，包括一些肠道菌、金黄色葡萄球菌、产胺菌等会产生对人体有害的代谢物质[23−25]。自然发酵鱼肉制品中的微生物往往因粗放的加工方式导致发酵菌群更加复杂，腐败微生物的生长也难以得到有效抑制。除了传统的发酵方式，很多研究通过添加发酵剂和发酵辅料进行发酵鱼的制作，添加发酵剂的方式（乳酸菌产生细菌素）能够有效控制腐败微生物的滋生[26]，发酵香辛料也能起到抑制产胺菌等有害微生物生长的作用[27]，从而保证发酵鱼在发酵质量上的可控性。

1.1 传统发酵鱼中的微生物

传统发酵鱼的工艺主要是自然发酵，鱼本身的微生物和发酵过程中的控制水平使得传统发酵鱼中微生物组成较为复杂，优劣菌并存于发酵制品中，大大限制了发酵鱼制品的质量和食用安全性。见表1。

表1 常见的自然发酵鱼制品Table 1 Common naturally fermented fish products

1.1.1 乳酸菌 乳酸菌是通过发酵碳水化合物产生乳酸的一类厌氧或兼性厌氧的球状或杆状菌株。发酵鱼制品在发酵过程中产生了令人满意的变化，乳酸菌在其中扮演了重要角色。乳酸菌主要有乳杆菌属、双歧杆菌属、链球菌属、明串珠菌、片球菌属等[11]。乳酸菌形态多样，但不具备孢子，运动性能较差，耐氧能力较强，乳酸菌通过自身产生的乳酸降低发酵过程中的pH进而抑制腐败微生物的生长繁殖。不仅如此，异型乳酸发酵菌产生的乙醇、乙醛、乙酸等香味物质，促进了发酵制品风味的形成[34]。

目前已有大量关于发酵鱼制品中乳酸菌的研究，刘璐等[35]在贵州黔东南地区的鱼酱酸中分离出15 株典型的产γ-氨基丁酸的乳酸菌，包括2株食窦魏斯氏菌、1株雄峰魏斯氏菌、11株植物乳杆菌和1株戊糖乳杆菌，其中植物乳杆菌Y279和Y64展现出良好的耐酸、耐盐、抑菌特点，可作为工业化生产的优良菌株。Harnentis等[7]在印度尼西亚本地发酵鱼中分离得到了10 株乳酸菌，鉴定为乳杆菌属，革兰氏阳性杆菌。Han等[36]在自发发酵的鱼茶中分离得到3株乳酸菌，包括2株植物乳杆菌和1株乳酸乳球菌。胡锦鹏等[11]对发酵鱼中乳酸菌的重要地位进行概述，阐明了乳酸菌在发酵鱼制品过程中的关键作用。林城杏[37]通过研究传统高盐发酵酸鱼，在6组样品中共分离到42株优良乳酸菌，其中24株为植物乳杆菌，占比高达57.14%，说明高盐发酵酸鱼的第一优势菌株为植物乳杆菌。在其他发酵食品中也有相似结果[38−39]，发酵过程中的优势菌多为乳酸菌，特别是在发酵鱼制品中，乳酸菌中的植物乳杆菌是发酵鱼制品的关键微生物。

1.1.2 葡萄球菌 葡萄球菌是一种发酵过程中的优势微生物，很多葡萄球菌在发酵过程中都能分泌酶来促进水产品的色泽、质地和风味的形成[40]。葡萄球菌的显著特点就是具有硝酸盐还原酶活性，在发酵肉制品时能够将NO3−还原为NO2−，当发酵鱼类时因为较低的pH，NO2−自然分解为NO，此时NO与鱼肉中的肌红蛋白相结合产生亚硝基肌红蛋白而使肉质呈现出诱人的红色[30]。目前，东南亚地区及日本地区的传统发酵鱼研究中分离出较多的葡萄球菌。Majumdar等[41]在印度传统发酵鱼Sheedal中分离到7株葡萄球菌，即S. piscifermentans、S. condiment、S. arlettae、S. sciuri、S. warneri、S. nepalensis和S. hominis，这7株葡萄球菌均表现出蛋白质水解和脂解的活性特点。Kanjan等[42]在泰国发酵鱼Budu中分离得到的葡萄球菌PMRS35在模拟胃肠道条件下，存活率达80%以上。Ngari是印度东北部的一种传统发酵鱼食品，Khusro等[43]在Ngari中分离得到对病原体抑制活性较强的腐生葡萄球菌，呈现出高耐酸性、疏水性和自聚集性的特点。

1.1.3 酵母菌 在鱼肉制品发酵中，酵母菌对发酵也有积极的促进作用。发酵初期的酵母菌数量一般较少，在发酵成熟到保藏期间酵母菌数量才有所增加[30]。Zeng等[44]在传统低盐（2%~3%）发酵酸鱼中共分离得到110株具有典型形态的酵母菌，并通过PCR和生化方法鉴定为酿酒酵母（70.9%）和异常汉逊酵母（29.1%），其中五株表现出较强的益生菌性状和理化性质，该研究通过筛选耐逆性（pH、温度、盐浓度）和蛋白水解、脂解活性较好的酿酒酵母菌来制作发酵剂，提高发酵质量。陈柔霖等[45]在鱼蛋白酶解液中分离得到7株酵母菌，经产香试验筛选出一株最佳产香酵母Y2，鉴定为长孢洛德酵母。

1.1.4 霉菌 从目前研究来看，霉菌在发酵鱼微生物区系中也是占有一定的数量。谢莉等[46]在传统发酵鱼露中分离到耐盐性霉菌，分子生物学鉴定为橘青霉（Penicillium citrinum），溶血性实验未出现溶血现象，通过转录组技术研究高盐胁迫下的代谢作用，该霉菌可缩短发酵时间。杨颖等[47]为克服速酿鱼露风味较差的缺陷，在鱼露中筛选出一株米曲霉作为后续实验的发酵剂，以大米作为种曲并配合分段加盐工艺有效的缩短了鳀鱼鱼露的发酵周期。米曲霉在高盐和低酸环境下活性较低，还有可能产生杂菌，因此霉菌在发酵鱼制品中的使用还需要进一步研究。

霉菌在鱼肉制品的发酵中作为优势菌出现多依靠人工接种为主，霉菌作为发酵剂进行肉制品发酵时会产生一定的风险，在选择霉菌菌种接种时要进行严格的菌种筛查工作，以此保证发酵的安全性。

1.2 人工接种发酵鱼中的微生物

由于自然发酵过程中微生物种类难以控制，导致自然发酵食品的品质会受到极大的影响。自然发酵由于添加不同比例的发酵原料，间接的也会影响到微生物菌群的变化。例如，食盐添加量较高会使某些不耐盐微生物难以成为发酵优势菌。由于自然发酵的不稳定性，接种发酵剂来增强发酵能力，缩短发酵周期，为工业化生产提供稳定的发酵方式提供了技术手段。与传统的自然发酵相比，接种发酵剂的发酵方式优势更加明显。见表2。例如，使特定的功能性菌株成为优势菌株，进而达到预期的发酵目标，通过优势菌株来抑制杂菌污染，提高发酵安全性；获得清晰的发酵进程，使发酵变得更容易控制，大大缩短发酵周期，降低了发酵的成本；利用特定的菌种代谢物来抑制某些有害物质的形成[49−50]。近年来，为提高发酵质量、缩短发酵周期、抑制生物胺等有害产物，应用复合发酵剂能够充分利用菌种间的协同作用加快发酵进程、提高产品质量。

表2 优良发酵剂的发酵特点Table 2 Fermentation characteristics of excellent starter

石健喜等[51]在传统发酵鱼中分离出植物乳杆菌、木糖葡萄球菌和酿酒酵母制成复合发酵剂进行发酵发现乳酸菌逐渐成为鲢鱼发酵过程中的优势菌，葡萄球菌在发酵24 h后增长速度变慢，可能是由于逐渐降低的pH抑制了葡萄球菌的生长，发酵36 h后，假单胞菌、肠杆菌明显受到抑制，可能是由于pH及抑菌物质的影响。Zhao等[52]采用黑曲霉和米曲霉混合发酵的方法，发现氨基酸、可溶性氮、游离氨基酸和谷氨酸的含量相较于只采用米曲霉发酵有不同程度的增加。试验结果均表明，采用混合发酵剂发酵鱼肉制品，氨态氮、游离氨基酸的含量得到提高，香气增加明显。

Zang等[53]利用高通量测序在研究有无接种发酵剂发酵酸鱼的微生物群落动态后发现，无论是否包含发酵剂培养物，乳酸菌、巨球菌、葡萄球菌都是整个发酵过程中的主要细菌。在接种发酵剂的样品中，酵母菌是发酵早期的主要菌类，到发酵后期主要菌类变为念珠菌和威克汉姆菌。与天然发酵的样品相比，接种发酵剂的样品对乳球菌、明串珠菌、肠球菌、弧菌、镰刀菌和孢圆酵母等均有抑制作用，对金黄色葡萄球菌的产生有显著的抑制作用[53]，该研究表明了混合发酵剂的接种抑制了许多导致食品变质微生物的生长。

Gelman等[54]利用分离到的乳酸菌作为发酵剂接种到鱼糜中，在10 ℃培养7 周后发现鱼糜中菌株特异性较强，在接种植物乳杆菌和肠膜明串珠菌的样品中对竞争菌群的抑制作用明显强于其他接种样品。Liao等[55]以植物乳杆菌、木糖葡萄球菌和酿酒酵母复合发酵剂接种样品，发现样品中的乳酸菌含量要明显高于接种了木糖葡萄球菌或酿酒酵母单一菌种样品中的乳酸菌数量。韩静[33]研究不同温度下自然发酵鱼茶的菌群分布发现，各组中的优势菌株在发酵第3周后开始确立，发酵鱼茶在15 ℃发酵条件下的优势菌株为沙克乳酸杆菌和植物乳杆菌，在20 ℃和25 ℃条件下的优势菌株是植物乳杆菌，30 ℃条件下的优势菌株是短乳杆菌。Zheng等[56]在研究中分离到一株嗜盐冷杆菌对pH和NaCl变化影响不明显，显著提高了嗜盐微生物的数量，进而加速了鱼露发酵进程。有研究表明，乳酸菌在发酵过程中快速产酸的同时，对腐败菌种和致病菌生长繁殖具有抑制作用[57]。吴永祥等[58]在研究臭鳜鱼发酵中指出传统的臭鳜鱼发酵得益于微生物菌群的系统发酵，实现臭鳜鱼的接种定向发酵需要筛选形成特殊风味的微生物，并了解微生物菌株的发酵机理、各种微生物间的协同作用及发酵环境条件。

2 发酵鱼中优势菌种的发酵特性

传统发酵鱼制品中的微生物是复杂多样的，微生物类型与发酵质量密切相关，了解优势菌种对提高各种原有大分子物质的降解能力，减少有害物的产生和提高发酵鱼制品的品质具有重要意义，见图2。对优势菌种的特定功能进行研究，将微生物的组成与代谢作用相结合，能更加清晰地了解到微生物与鱼肉中物质的作用机理[59]，从而筛选特定的优势菌种作为发酵剂，稳定发酵过程，达到提高发酵质量的目的，为工业化生产发酵鱼制品提供理论支持。

图2 优势微生物发酵作用机理Fig.2 Fermentation mechanism of dominant microorganisms

2.1 抑制腐败微生物生长

乳酸菌作为发酵鱼制品中的优势菌株，对食源性病原体和腐败菌均有抑制作用[60]。乳酸菌能代谢合成各种抗菌性化合物，如有机酸、双乙酰、罗伊氏菌素、细菌素[26]等。刘璐等[35]在鱼酱酸中分离出的15株乳酸菌能够快速产酸，表现出较强的耐酸、耐胆盐性，抑菌实验中抑菌液有明显抑菌圈，研究表明植物乳杆菌Y64和Y279若作为发酵剂接种能快速产酸抑制不耐酸微生物的生长。童火艳[61]利用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌作为指示菌，对5株乳酸菌（乳酸片球菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、短乳杆菌和干酪乳杆菌）抑菌能力进行测定，发现植物乳杆菌的抑菌能力最强。林城杏[37]在发酵酸鱼中筛选出产细菌素乳酸菌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有明显抑制效果，且菌株具有良好的耐盐、耐酸、耐热特性。根据以上研究发现，乳酸菌中植物乳杆菌抑菌能力更加突出，作为发酵剂可快速产酸，显著降低环境的pH，抑制腐败微生物的生长繁殖。

2.2 促进大分子物质降解

发酵鱼肉中的脂肪降解程度对品质有着重要的影响。不同的微生物对脂肪降解效率有显著差异[62]。Xu等[62]在酸鱼中接种植物乳杆菌120、木糖葡萄球菌135和酿酒酵母31，发现接种发酵剂样品中的游离脂肪酸含量有不同程度的增加，表明接种的发酵剂可以促进游离脂肪酸的脂解和释放，其中木糖葡萄球菌135具有更高的脂肪分解活性。有报道指出，利用植物乳杆菌、木糖葡萄球菌和酿酒酵母菌发酵酸鱼后单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸含量均有大幅增加，进一步研究得出木糖葡萄球菌可促进脂质降解，延缓脂肪酶活力下降速率，酵母菌则可以抑制磷脂氧化，对不饱和脂肪酸的抗氧化能力较强[48,63]。脂质降解是鱼肉发酵过程中重要的生化变化，目前研究指出酵母菌中的酿酒酵母和葡萄球菌中的木糖葡萄球菌对脂质降解起到关键作用。

蛋白质降解也是发酵过程中的重要生化反应，葡萄球菌在代谢过程中能分泌蛋白质降解酶，木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌的混合发酵剂有助于发酵肉制品中蛋白质的降解[14]。高继庆等[64]接种木糖葡萄球菌发酵海鲈鱼发现游离氨基酸含量随发酵时间延长而增加，发酵60 h后，含量增加61.07%，并且木糖葡萄球菌在发酵过程中能利用氨基酸生长代谢。鱼肉中的蛋白质包括肌浆蛋白、肌原纤维蛋白和不溶性蛋白[65]，发酵过程中蛋白质降解引起氨基酸含量和TCA-溶解肽含量上升，表明木糖葡萄球菌对蛋白质中的肌浆蛋白和肌原纤维蛋白降解有重要影响。

2.3 提高发酵鱼品质

微生物在发酵鱼风味形成中扮演着重要角色，传统发酵鱼气味主要包括醛、醇、酮、酸、酯类、含氮、硫化合物等成分，在接种发酵剂的鱼制品中醛和醇类为主要的挥发性气味物质[66]。张洵等[19]以乳酸菌和酵母菌为发酵剂接种到鱼糜中进行发酵，酵母菌可以分解碳水化合物中的醇并与乳酸菌产生的酸生成酯类，赋予鱼糜特殊的酯香。Zang等[20]在鲤鱼中接种发酵剂，在发酵样品中共检测到17种游离氨基酸、22种游离脂肪酸和81种香气物质，其中乳酸菌参与了大部分风味物质的形成，葡萄球菌、肠球菌、酵母菌、念珠菌也对风味形成起到了积极作用。朱露露等[67]将酵母菌作为发酵剂接种到鲟鱼中产生了乙酸乙酯、乙酸异戊脂和3-甲基丁醛等风味物质。李春生等[68]在鱼制品发酵过程中检测到387种菌参与风味形成，在发酵后检测出54种挥发性气味化合物，其中嗜盐单胞菌与风味物质2-甲基丙醛呈正相关关系，表明嗜盐单胞菌可能会促进发酵过程中麦香味的形成，并对除三甲胺外的8种风味形成起到促进作用。发酵鱼肉制品香味的形成多归功于酵母菌[19]，其中酿酒酵母和毕赤酵母是发酵鱼制品中常见的酵母菌发酵剂。

生物胺是发酵鱼食品中常见的一类有害化合物，生物胺对人体有一定的积极作用，但是当积累量超过一定限度时，则会引起头疼、心悸、呕吐等毒性作用[69]。由于发酵鱼食品中生物胺的存在，研究减少生物胺含量对提高发酵鱼发酵质量具有重要意义。一直以来，许多研究均报道了微生物在培养基、缓冲液和发酵食品中降解生物胺的能力。朱翠翠等[70]在天然发酵的鱼露中分离出一株对组胺具有高效降解能力的毕赤酵母菌株，在组胺浓度为50 mg/L时降解率高达82.61%，进一步研究显示该菌株对组胺、酪胺、尸胺、腐胺、色胺、β-苯乙胺、亚精胺和精胺均有不同的降解能力。在发酵鱼产品中，鱼露的平均生物胺水平较高，接种发酵剂发酵鱼露可以减少或预防生物胺的形成[71]。袁树坤[72]在鱼露优势微生物与生物胺相关性研究中发现在整个鱼露发酵期间亚精胺和精胺是主要的生物胺，其含量与显性假单胞菌属、变形杆菌属、普罗威斯登菌属含量呈负相关，四联球菌属被认为是减少鱼露发酵过程中生物胺含量的主要微生物。刘忠义等[73]在鱼糜中接种乳酸菌和酵母菌作为混合发酵剂进行发酵发现鱼糜中腐胺、组胺、酪胺、精胺和亚精胺的含量相较于未接种的发酵鱼糜明显降低。目前，有关发酵鱼中生物胺降解菌的研究集中在乳酸菌（乳杆菌）、葡萄球菌、酵母菌（酿酒酵母、毕赤酵母）、霉菌（红曲霉）几种微生物中[74]，因此选择合适的优势菌作为发酵剂是降低生物胺的关键生产步骤。

3 结论与展望

发酵是鱼制品加工的重要方式，鱼肉风味、质地、色泽、营养能够在发酵过程中得到增强。目前，大多数发酵鱼制品工业化程度较低，传统发酵鱼肉制品微生物区系复杂，发酵过程中往往会产生杂菌，导致发酵质量参差不齐；接种发酵剂培养优势菌发酵鱼肉能够获得良好的产品品质。微生物代谢活动在鱼肉发酵中扮演着重要的角色，特别是优势菌种在发酵过程中起到抑制杂菌生长、促进蛋白脂肪降解、抑制有害物产生、增加产品风味的作用。关于发酵鱼制品中微生物组成和品质特征的关系还需要不断地深入探索，将发酵剂发酵技术和代谢组学技术及高通量测序技术等相关领域学科知识结合起来应用，对发酵鱼制品品质和市场开发具有重大意义。