ApoE与SLCO1B1基因多态性与老年脑梗死患者颅内动脉粥样硬化狭窄的相关性

张慢，王琦，刘清林，林博

(北京中医药大学东方医院检验科，北京 100078)

有研究显示，在老年人心脑血管疾病中脑血管的病死率远高于冠心病[1]。高龄患者以慢性缺血性脑血管病最为常见，其发病除与男性、年龄、高血压、糖尿病、脑血管病及他汀类药物有关外，还与血脂代谢及动脉粥样硬化狭窄有关。有研究显示，动脉粥样硬化狭窄的病理变化不仅受环境因素和生活习惯的影响，还与载脂蛋白E(apolipoprotein，ApoE)和有机阴离子转运体1B1(solute carrier organic anion transporter family member 1B1，SLCO1B1)基因调控相关[2]。目前针对ApoE和SLCO1B1的研究主要为基因多态性对他汀类药物和抗肿瘤药等药代动力学等的影响，而与动脉粥样硬化狭窄的相关性研究较少。因此，本研究旨在探讨ApoE与SLCO1B1基因多态性对老年脑梗死(cerebral infarction，CI)患者颅内动脉粥样硬化狭窄的影响，并分析动脉粥样硬化狭窄程度与血脂的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2018年2月至2019年2月北京中医药大学东方医院200例脑梗死患者的临床资料，为脑梗死组。纳入标准：经磁共振成像检查结果证实，符合2017年《中国脑梗死中西医结合诊治指南》[3]；入组前2周未服用过降脂药物或诱导肝药酶的药物或食物；均存在运动量少、饮食热量高及吸烟饮酒等不良生活史；无近亲结婚及异族通婚史。排除标准：由心源性、炎症性及肿瘤等引起的缺血及出血性脑血管病；中重度营养不良；妊娠或哺乳期女性；资料不全。将脑梗死组患者按照狭窄程度[4]分为无狭窄(n=26例)、轻度狭窄(n=48例)、中度狭窄(n=45例)及重度狭窄者(n=81例)。并选取同时期健康人70名为对照组。

1.2 仪器与试剂

仪器：荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪(盐城市安信实验仪器有限公司)、全自动基因芯片检测仪[亚能生物技术(深圳)有限公司]、基因芯片阅读仪[亚能生物技术(深圳)有限公司]、微量紫外光光度计(上海美普达仪器有限公司)及医用冰箱。试剂：ApoE与SLCO1B1基因芯片检测试剂盒(宁波普瑞柏生物技术股份有限公司)、血液基因组DNA提取检测试剂盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 颅内血管狭窄程度的判断标准 患者取仰卧位，应用CT血管成像(computed tomography angiography，CTA)自升主动脉弓到颅底进行螺旋扫描，并应用北美症状性颈动脉内膜剥脱术研究(North American Symptomatic Carotid Endarterectomy Trial，NASCET)标准计算颅内动脉狭窄率并进行程度评估。将颅内动脉分为4个等级：无狭窄(狭窄率=0%)、轻度狭窄(0%<狭窄率<50%)、中度狭窄(50%≤狭窄率<70%)及重度狭窄(70%≤狭窄率100%)。

1.3.2ApoE与SLCO1B1多态基因检测 (1)血液样本的采集：采集研究对象肘静脉血4 ml，置于EDTA抗凝管中(抗凝剂用EDTA-2K)。(2)基因组DNA片段提取：应用血液基本组DNA提取检测试验盒，按其说明书进行操作。对提取的DNA采用MD2000型微量紫外光光度计进行检测，DNA吸光度A260 nm/A280 nm在1.8～2.0，DNA浓度在5～15 mg/L，基因组DNA于冰箱-20 ℃下进行保存。(3)基因组DNA片段的扩增：反应程序为50 ℃ 2 min，95 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s，65 ℃ 45 s，各45个循环，开始进行PCR扩增。(4)检测位点及结果判读：结合PCR体外扩增方法，采用基因芯片检测技术，对ApoE与SLCO1B1多态性位点按照试剂盒说明书进行检测，做空白对照及弱阳性对照，然后进行荧光信号的采集，结果为FAM(ApoE2526C，ApoE4388T；SLCO1B1*1b 388A，SLCO1B1*5521T)和VIC(ApoE2526T，ApoE4388C；SLCO1B1*1b 388G，SLCO1B1*5521C)。结果的判读由专业人员操作完成。

1.3.3 资料收集与临床指标检测 进行人口学资料调查，包括男性、年龄、高血压病史、糖尿病史、吸烟史及饮酒史等。受试者于清晨空腹抽取静脉血5 ml，对总胆固醇(total cholesterol，TC)、酰油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)等进行检测。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 脑梗死组与对照组患者一般资料比较

脑梗死组高血压史、糖尿病史、吸烟史、LDL-C、ApoE、SLCO1B1均高于对照组，而HDL-C低于对照组(P<0.05)；2组男性、年龄、饮酒史、TC和TG比较，差异均无统计学意义(均P>0.05；表1)。

表1 2组患者一般资料比较

2.2 不同程度动脉粥样硬化狭窄患者与ApoE基因多态性的分布

ApoE等位基因中以ε4狭窄率最高，在ApoE基因型中以ε3/ε3狭窄率最高，差异均有统计学意义(均P<0.05; 表2)。

2.3 颅内动脉粥样硬化狭窄程度与SLCO1B1基因多态性的关系

SLCO1B1等位基因中388A>G、521T>C分别以GG、TT狭窄率最高，但不同程度粥样动脉硬化狭窄患者的388A>G、521T>C基因型分布比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)；SLCO1B1*1b与SLCO1B1*5基因型组合中1b/1b狭窄率最高，但各基因型组合在不同程度粥样动脉硬化狭窄患者中的分布比较，差异均无统计学意义(均P>0.05；表3)。

表3 颅内动脉粥样硬化狭窄程度与SLCO1B1基因多态性的关系

2.4 颅内动脉粥样硬化狭窄程度与血脂成分的关系

随着动脉粥样硬化狭窄程度的加重，TC、TG、LDL-C浓度逐渐增加，HDL-C浓度逐渐下降，差异均有统计学意义(均P<0.05；表4)。

表4 颅内动脉粥样硬化狭窄程度与血脂成分的关系

2.5 颅内动脉粥样硬化狭窄程度影响因素的logistic回归分析

以老年CI患者颅内动脉粥样硬化狭窄发生与否(是=1，否=2)为因变量，以男性、年龄、高血压、糖尿病、脑血管病、他汀类药物、TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoE等位基因(ε4)、ApoE基因型(ε3/ε3)为自变量，应用logistic回归分析动脉粥样硬化狭窄影响，结果显示：LDL-C、ApoEε4、ApoEε3/ε3是老年CI患者发生颅内动脉粥样硬化狭窄的危险因素(表5)。

表5 颅内动脉粥样硬化狭窄程度影响因素的logistic回归分析

3 讨 论

有研究证实，动脉粥样硬化是脑梗死的主要病理基础[5，6]。研究显示ApoE基因多态性与个体血脂水平存在差异性[7]，而SLCO1B1不同基因型患者的血清血脂指标变化率无明显差异[8]。有文献证实，血脂异常是脑梗死的危险因素[9]。基于此，本研究分析了脑梗死患者ApoE、SLCO1B1与颅内动脉粥样硬化狭窄间的关系。

由本研究结果可得，脑梗死组的高血压史、糖尿病史、吸烟史、LDL-C、ApoE、SLCO1B1、HDL-C与对照组相比差异著性。与肖林婷等[10]报道相似，他们认为在脑梗死患者中ApoE基因型中ε3/ε3起到了重要的保护作用，提示ApoE与脑梗死患者颅内动脉粥样硬化狭窄相关。Wu等[11]报道，与对照组相比，脑梗死患者的SLCO1B1基因型和单倍型频率无统计学差异，与本研究的论点相一致，且本研究进一步论证了在不同程度动脉粥样硬化狭窄患者中SLCO1B1的388A>G、521T>C基因型分布比较差异无统计学意义，说明在本研究中SLCO1B1基因及基因组合对患者颅内动脉粥样硬化狭窄发生无影响，提示SLCO1B1与颅内动脉粥样硬化狭窄无关。但罗宝昌等[12]研究显示，SLCO1B1基因多态性可能与缺血性脑卒中有关。我们分析可能与本研究样本来源单一且较少有关。

孙成芝等[13]经过Spearson相关性分析显示，oxLDL、LTB4与TC、TG、LDL-C、空腹血糖呈正相关，与HDL-C呈负相关，与本研究结果相一致。国外学者Pendlebury等[14]研究发现，在短暂性脑缺血发作和中风患者中，ApoE-ε4纯合性与事件前和事件后痴呆有关；肖林婷等[10]发现，海南省男性而非女性脑梗死患者中ApoEε3/ε3和ε3/ε4基因型起到了很重要的保护性作用；但吉维忠等[15]认为，ε4可能是脑血管疾病的保护因素；魏二佳等[16]研究认为ApoE基因ε2可能是潮汕人群中SDICH的风险因子。推测结论不一致原因可能：(1)ApoE等位基因分布存在种族差异；(2)检测方法不同会导致结果不一致；(3)样本量选取的问题等。

综上，本研究从基因多态性角度分析了ApoE、SLCO1B1在老年脑梗死患者不同程度动脉粥样硬化狭窄中的分布情况，及硬化狭窄程度与血脂的关系。总体来说，LDL-C、ApoEε4、ApoEε3/ε3是影响动脉粥样硬化狭窄的主要因素，而SLCO1B1基因及基因组合对患者颅内动脉粥样硬化狭窄发生无影响。ApoE基因多态性对动脉硬化狭窄的影响是通过血脂代谢，还是作为遗传易患病基因参与其发生发展过程，需要我们日后继续扩大样本量，进一步开展个性化干预进行深入研究与探讨。