复合添加剂对花生秧青贮品质的影响

田吉鹏， 韦 青， 刘蓓一， 许能祥， 丁成龙， 顾洪如

(江苏省农业科学院畜牧研究所， 农业农村部种养结合重点实验室， 江苏 南京 210014)

花生(ArachishypogaeaLinn.)在我国广泛种植，每年产量达1 700多万t。花生收获后剩余的花生秧具有丰富的营养物质且瘤胃消化率高，十分适合被反刍动物利用。据研究，花生秧在瘤胃的干物质及粗蛋白降解率均显著高于豆秸、玉米秸等其他秸秆[1]。饲喂花生秧可以提高畜禽生产性能和胃肠道消化功能、维持肠道菌群平衡，提高免疫力[2]。我国黄淮海地区反刍动物舍饲养殖规模庞大，优质牧草资源缺乏，同时也是我国花生的主产地。充分利用花生秧饲料资源可以有效解决优质粗饲料短缺的难题，保证我国黄淮海农区反刍动物产业的可持续发展。

青贮是保存粗饲料营养成分、提高消化率的有效手段。花生属于豆科植物，缓冲能值高，可溶性碳水化合物含量低，附着乳酸菌数量少，难以有效青贮。同时花生品种较多，不同品种花生秧营养品质差异较大[3]，也增大了花生秧青贮饲料添加剂的应用难度。现有研究多将狼尾草(Pennisetumalopecuroides(L.) Spreng.)、全株玉米(ZeamaysL.)、高粱(Sorghumbicolor(L.) Moench)等与花生秧进行混合青贮[4-6]。添加外源乳酸菌及农产品副产物同样能够提高青贮发酵质量,抑制有害微生物，在花生秧以及苜蓿等豆科青贮饲料中取得良好的效果[7-8]。玉米芯是玉米果穗脱去籽粒后的穗轴，营养成分丰富，与其他原料通过混合青贮能够提高青贮饲料质量和反刍动物的生产性能[9]。稻壳粉(OryzasativaL.)营养成分含量少，但是添加进花生秧青贮中能够降低缓冲能值，提高干物质含量，提高青贮发酵效果[10]，同时经过发酵亦可提高稻壳粉营养价值和消化率[11]。目前尚未有花生秧与玉米芯或稻壳粉混合青贮的相关报道。本研究将花生秧与玉米芯或稻壳粉进行混合青贮，同时添加复合乳酸菌制剂，旨在探索针对不同花生秧品种的最佳复合添加剂组合,以提高花生秧青贮的成功率和发酵质量，为花生秧的饲料化利用提供理论依据及技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

花生秧来自于江苏省农业科学院试验地，花生品种为江苏省农业科学院培育的品种‘027’(H1品种)和‘047’(H2品种)，花生收获期收获，留茬高度5 cm。乳酸菌采用江苏省农业科学院畜牧所自研复合乳酸菌，主要菌种包括植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)和副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)，活菌数>5×1010CFU g-1。玉米芯和稻壳粉自当地市场购得。

1.2 试验设计

试验采用双因素完全随机设计，两个花生秧品种H1和H2，每个品种分别用蒸馏水(CK组)，复合乳酸菌(LAB组)，复合乳酸菌及玉米芯(LAB+C组)，复合乳酸菌及稻壳粉(LAB+R组)进行处理，每个处理3个重复。

将新鲜收割的花生秧用铡刀均匀切割为2～3 cm的小段并混合均匀。将复合乳酸菌加入2 mL灭菌脱脂奶粉溶液中室温活化2 h，加入适量水(20 mL)溶解均匀喷洒进青贮料中。其中CK组和LAB组每个品种取1 kg，分别均匀喷洒等量蒸馏水及乳酸菌液，其中乳酸菌的添加量为5×105CFU·g-1，CK组用蒸馏水等量喷洒。LAB+C和LAB+R组中各自添加花生秧鲜样5%的玉米芯和稻壳粉，每份1 kg，并均匀喷洒乳酸菌液，乳酸菌的添加量与LAB组相同。将每份1 kg均匀分为3份分别装入青贮袋中并用真空包装机抽取真空密封后作为3个重复。全部完成后放入20～25℃储藏室中包裹黑色塑料袋遮光储存1年。

1.3 测定项目及方法

1.3.1发酵品质测定 开封后每个青贮袋中青贮饲料混合均匀，从中均匀取20 g青贮料加入250 mL锥形瓶中，加入180 mL蒸馏水，放入4℃冰箱中浸提24 h，浸提后用4层纱布和定性滤纸过滤，用于pH值的测定，剩余浸提液立即保存于—20℃冰箱中用于氨态氮和有机酸含量的测定。其中pH值的测定采用梅特勒公司的玻璃电极pH计进行测量。采用安捷伦公司的高效液相色谱仪(配备紫外检测器)测定乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的含量[12]。分析条件如下：色谱柱为Shodex RSpak KC-811S-DVB gel C(8.0 mm×30 cm，岛津公司)；进样体积为5 μL；流动相为3 mM HClO4；流速为1 mL·min-1；柱温为60℃；检测波长为210 nm；运行时间20 min。采用苯酚-次氯酸钠法测定氨态氮含量[13]。

1.3.2微生物数量测定 青贮袋开封后立即称取测定微生物数量所需样品，取每个样品后更换一次性PE手套和无菌取样袋。取混合均匀的20 g样品放入250 mL锥形瓶中，加入180 mL灭菌生理盐水，室温条件下在振荡器中震荡30 min后立即用于乳酸菌、酵母菌和霉菌的计数。无菌条件下用移液枪吸取1 mL混匀的菌悬液加入装有9 mL无菌生理盐水的试管中震荡均匀，反复稀释得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的菌悬液。用MRS培养基(北京陆桥技术有限公司)对乳酸菌进行计数，平板倒置于37℃恒温培养箱中有氧培养48 h，选择乳酸菌菌落数在30～300内的稀释度培养皿计数。用孟加拉红培养基(北京陆桥技术有限公司)对酵母菌和霉菌进行培养，28℃恒温培养箱中培养3～7 d，选择酵母菌菌落数在30～300内的稀释度培养皿计数，选择霉菌菌落数在10～100内的稀释度培养皿计数。

1.3.3营养品质和体外消化率测定 取250 g样品放在105℃烘箱中杀青15 min，然后65℃烘箱中烘干约48 h至恒重，称重计算干物质(Dry matter，DM)含量，烘干后样品粉碎过1 mm筛并用于营养品质和体外消化率的检测。采用凯式定氮法检测总氮(Total nitrogen，TN)含量[14]，粗蛋白含量以TN×6.25进行计算。中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量采用安康公司的Ankom200i纤维检测仪进行检测，测定方法为范式法[14-15]。采用体外降解法测定干物质的体外降解率(Invitrodigestibility of dry matter，IVDMD)，具体采用胃蛋白酶-纤维素酶测定法[16]。

1.4 数据分析

相关试验数据采用Excel 2016进行初步整理和分析，用SPSS 20数据处理系统进行进一步分析。利用一般线性模型对品种(H)、添加剂(A)以及交互效应(H×A)进行方差分析。交互效应显著的(P<0.05)进一步进行多重比较，多重比较方法采用Tukey法，交互效应不显著但主效应显著的(P<0.05)进一步对总体均值进行多重比较，多重比较方法同样采用Tukey法。各处理以“平均值±标准差”来进行表示。

2 结果与分析

2.1 发酵品质分析

花生秧青贮饲料发酵品质相关数据见表1。从总体均值上看，H1和H2品种在pH值、乳酸和乙酸含量以及乳酸/乙酸比值上存在显著差异(P<0.01)。同样，添加剂的使用在pH值、乙酸含量、乳酸/乙酸比值和氨态氮含量上具有显著差异(P<0.01)。花生品种和添加剂的交互效应(H×A)显著影响了花生秧青贮饲料的各项发酵指标(P<0.01)。与CK相比H1品种中LAB，LAB+C和LAB+R处理均能有效降低青贮饲料的pH值。H2品种中只有LAB+C处理组的pH值显著低于CK组(P<0.05)。H1品种中LAB+C、LAB+R处理组的乳酸含量较高，均超过6.3%DM，显著高于H2品种中的同样添加剂组合(P<0.05)。LAB+C和LAB+R处理组的乙酸含量在H1品种和H2品种中均显著低于LAB处理组(P<0.05)，但只有在H2品种中显著低于CK组(P<0.05)。H2品种的CK组和LAB组具有较高的乙酸含量(P<0.05)。H1品种的LAB+C处理组具有最高的乳酸/乙酸比值(P<0.05)，显著高于H1品种的CK组和其他添加剂组(P<0.05)。H2品种的LAB+C和LAB+R处理组的乳酸/乙酸比值也显著高于H2品种的CK和LAB组(P<0.05)。H1品种的CK组以及H2品种的CK组和LAB组氨态氮含量最高，超过了13%TN。LAB+C和LAB+R处理组在H1和H2品种中相比于CK组均能显著降低氨态氮含量，其中LAB+C组效果最好，在H1和H2品种中均低于10%TN。H2品种中的LAB+C组具有最低的氨态氮含量，为8.17%TN。丙酸和丁酸在本次研究中未检出。

表1 不同品种和添加剂对花生秧青贮饲料发酵品质的影响Table 1 The influence of different varieties and additives on the fermentation quality of peanut vine silage

2.2 微生物数量分析

由表2可知，不同品种乳酸菌数量和霉菌数量存在显著差异(P<0.01)，而添加剂的使用从总体上对乳酸菌、酵母菌和霉菌数量也有显著影响(P<0.01)。品种和添加剂的互作效应对于乳酸菌和霉菌数量具有显著影响(P<0.01)。H1品种的LAB处理组具有最高的乳酸菌数量，且显著高于CK组(P<0.05)，但在H2品种中LAB组与CK组无显著差异。在两个品种中LAB+C以及LAB+R处理组乳酸菌数量显著低于CK组和LAB组(P<0.05)。H1品种的LAB+R组从数值上看具有最小的乳酸菌数量。添加剂的使用能够显著影响酵母菌数量(P<0.01)。LAB+R和LAB+C处理组酵母菌的总体均值分别为1.78和2.67 lgCFU·g-1，相比于CK组和LAB组的总体均值0.71和0.78 lgCFU·g-1，显著提高了酵母菌数量(P<0.05)。青贮后H1品种花生秧青贮霉菌数量未检出，只有H2品种的LAB+C处理组有少量霉菌检出，但数量极少。

表2 不同品种和添加剂对花生秧青贮饲料微生物数量的影响Table 2 The influence of different varieties and additives on the microbial counts of peanut vine silage

2.3 营养品质分析

由表3可知，两个品种的青贮饲料在干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素含量方面均具有显著性差异(P<0.01)，而添加剂对于花生秧青贮饲料的干物质含量、粗蛋白、酸性洗涤木质素含量以及体外干物质消化率具有显著影响(P<0.01)，但是仅在干物质含量上品种和添加剂具有显著的交互效应(P<0.05)。H1组干物质含量和粗蛋白含量显著高于H2组(P<0.01)，中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素含量显著低于H2品种(P<0.01)。添加剂LAB+C和LAB+R组显著增加了青贮饲料的干物质含量(P<0.01)，显著降低了青贮饲料的粗蛋白含量(P<0.01)。H1品种的CK组和LAB组粗蛋白含量较高，超过11.4%。添加剂LAB+C具有最低的酸性洗涤木质素含量，且显著低于LAB+R处理组(P<0.05)。从整体上看，添加剂的添加对于中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量无显著影响。体外干物质消化率在青贮后总体保持平稳，不受品种的影响。添加剂尤其是LAB组和LAB+C组相比CK组能够显著提高体外干物质消化率(P<0.05)。

表3 不同品种和添加剂对花生秧青贮饲料营养品质和体外消化率的影响Table 3 The influence of different varieties and additives on the nutrition value and in vitro digestibility of peanut vine silage

3 讨论

在花生秧青贮饲料中未检出丙酸和丁酸，这表明丙酸菌和丁酸菌的发酵受到了抑制。同时酵母菌和霉菌的数量也很少。整体花生秧青贮饲料中以乳酸菌发酵为主。在长时间的青贮过程中所有处理的花生秧青贮饲料均得到了很好的保存。一般我们认为青贮饲料的pH值最好低于4.2[17]，但是对于豆科植物来说，由于其成分复杂，蛋白质含量较高，很难使其pH值低于4.2[7]，只要能够有效抑制梭菌、酵母菌和霉菌等的活动，仍能得到发酵质量良好的青贮料。在花生秧中添加乳酸菌制剂和农产品加工副产物能够有效降低青贮饲料的pH值，这与Qin等[8]的研究相一致。本研究中LAB+C处理组的pH值最低，在H2品种中最低可以达到4.27。这可能是因为在花生秧青贮饲料中引入了玉米芯等禾本科植物加工过程中剩余的副产物，降低了青贮饲料的缓冲能，虽然乳酸含量没有明显提高，但是pH值明显降低。同时，玉米芯和稻壳粉等农产品加工副产物干物质含量较高，添加进花生秧青贮饲料当中能够提高青贮饲料的干物质含量，本试验当中青贮饲料中的干物质含量由30%左右提高到了33%左右，更加适合乳酸菌进行发酵[18]。这与杜昭昌等[10]的结果相似。

乳酸与乙酸的比值代表了青贮饲料中同型发酵和异型发酵的占比，比值越大同型发酵程度越高[17]。同型发酵乳酸菌和异型发酵乳酸菌组合形成的复合乳酸菌添加剂能够有效提高青贮饲料的发酵品质，抑制真菌等有害微生物繁殖，提高青贮饲料有氧稳定性[19]，是目前商业青贮添加剂应用中的主要品种。本试验所用乳酸菌LAB为复合乳酸菌，里面同时包含同型发酵和异型发酵乳酸菌。在本团队之前的研究中该复合乳酸菌能够显著提高青贮饲料发酵品质[20]。在本研究中LAB处理组的乳酸和乙酸的比值低于CK组、乙酸含量高于CK组，证明布氏乳杆菌等异型发酵乳酸菌在花生秧青贮饲料中产生了效果。LAB+C和LAB+R处理组的乳酸和乙酸比值比LAB组高，乙酸含量比LAB组低，这可能是因为玉米芯和稻壳粉的添加增加了可溶性碳水化合物含量，提高了植物乳杆菌等同型发酵乳酸菌的发酵效率。该结果与Tian等[7]利用麦麸和玉米皮提高植物乳杆菌在苜蓿青贮饲料中发酵效果的研究相似。王思伟等[6]的研究表明，花生秧和全株玉米的混合青贮中随着花生秧比例的增加pH值和乙酸含量显著增加。在本研究中，添加稻壳粉和玉米芯显著降低了青贮中的pH值和乙酸含量。花生秧青贮饲料4.6左右的pH值仍然较高，在花生秧等豆科植物中适当引入禾本科饲草及相应副产物有助于提高同型发酵乳酸菌的发酵效果，提高青贮品质。同样的在秸秆当中加入适量的高蛋白饲料原料与乳酸菌添加剂能够提升青贮饲料发酵品质[21]。本研究中品种和添加剂之间存在显著的交互效应，且这种交互效应主要体现在发酵品质和乳酸菌数量上，这可能主要因为复合乳酸菌中植物乳杆菌等同型发酵乳酸菌和布氏乳杆菌等异型发酵乳酸菌的发酵效果受到了原料营养成分的影响。说明通过品种的选择以及稻壳粉和玉米芯等农产品加工副产物的应用，可以提高复合乳酸菌制剂中不同菌株的发酵效果。

氨态氮含量能够表征青贮饲料中蛋白质的降解情况，主要由梭菌产生，氨态氮的含量越高，青贮品质越差[22]。当青贮饲料本身蛋白质含量较高时，添加适当比例的禾本科农产品副产物能够降低氨态氮含量。如姜俊芳等[23]研究表明，在稻壳添加量低于30%的时候，随着稻壳添加量的增加高蛋白的笋壳青贮中氨态氮含量是下降的。但是对于蛋白质含量低一点的全混合日粮，随着稻壳比例从0%到5%再到10%，氨态氮含量是增加的[24]。本试验中添加稻壳粉和玉米芯及乳酸菌的复合添加剂能够显著降低青贮饲料中氨态氮含量，相对来说玉米芯的效果更好。原因在于添加剂及农产品加工副产物的添加提高了青贮饲料的发酵品质，抑制了蛋白质降解菌的繁殖，降低了氨态氮含量。同时玉米芯本身蛋白质含量较低，降低了青贮饲料的总氮含量，相对于其他添加剂相应的氨态氮产生量较低。

相比H1品种，H2品种蛋白质含量较低，纤维组分(中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和酸性洗涤木质素)含量更高，受稻壳粉和玉米芯的影响小一些，但是添加稻壳粉和玉米芯及乳酸菌的复合添加剂后氨态氮含量降低幅度更大，pH值更低。目前尚未有针对花生秧不同品种青贮效果的比较研究，但是两个品种发酵品质的差异多与蛋白质含量的高低有关。H1品种蛋白质含量较高，需要更多乳酸菌产生乳酸以提高发酵品质，而H2品种则更接近达到优质青贮发酵效果。添加稻壳粉和玉米芯降低了花生秧青贮饲料的蛋白质含量，但在H1品种的青贮饲料中蛋白质含量仍超过10%。添加玉米芯及乳酸菌复合添加剂能够有效降低花生秧青贮饲料的木质素含量，同时对于干物质体外消化率提升效果最好。这与Valadares等[25]利用玉米芯添加进甘薯藤(Dioscoreaesculenta(Lour.) Burkill)青贮中的效果相似。乳酸菌等对青贮饲料的体外消化率具有显著的促进效果[26]，这与本研究的结果是相似的。同样的体外消化率的变化主要是由于乳酸菌提高了青贮饲料的发酵品质，降低了非纤维营养成分的流失，从而提高了花生秧青贮饲料的体外消化率，而玉米芯的酸性洗涤木质素含量较低，对于提高体外干物质消化率也有一定作用。因为本研究所用复合添加剂包含3种乳酸菌及辅料，影响因素复杂，难以从理论上进一步进行分析及比较，后续将开展单一乳酸菌菌株与农产品加工副产物的复合添加研究，进一步分析提高青贮饲料体外干物质消化率的原因并提供进一步改进方案。

4 结论

乳酸菌、稻壳粉和玉米芯的使用能够有效提高花生秧青贮饲料的发酵品质。粗蛋白含量更高的花生秧品种更需要添加复合添加剂以提高青贮发酵质量。在两个品种当中，乳酸菌和玉米芯的组合使青贮具有最低的pH值和氨态氮含量以及最高的乳酸/乙酸比值，同时能够降低青贮饲料的木质素含量，提高体外干物质消化率。综上所述，乳酸菌和玉米芯的组合提高花生秧青贮饲料青贮品质的效果最好。