麦冬皂苷D 对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用及机制研究

赵玲琳，张勇，薛慧，刘洁

心肌缺血再灌注损伤不仅影响缺血性心血管疾病的治疗效果还可影响患者病情转归[1-2]。大量研究表明，心肌缺血再灌注可能通过复杂的病理生理机制导致心肌细胞损伤，包括细胞凋亡、炎症反应、氧自由基增多、钙超载和血小板聚集等[3-4]。麦冬皂苷D 是从传统中药麦冬中提取的一类皂苷类成分，具有抗炎、抗氧化和增强心血管功能等多种生物活性[5-6]。以往研究发现，麦冬皂苷D 通过调节线粒体动力学减轻糖尿病心肌损伤[7]。但关于麦冬皂苷D 在心肌缺血再灌注损伤中的作用鲜有报道。本实验通过缺氧复氧干预心肌细胞H9c2 构建心肌细胞缺血再灌注损伤模型，观察麦冬皂苷D 对心肌缺血再灌注损伤的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠心肌细胞H9c2 购自上海吉凯基因化学技术有限公司，由本实验室保存；胎牛血清购自美国Gibco 公司；低糖DMEM 培养基、胰蛋白酶购自美国Hyclone 公司；麦冬皂苷D 购自上海一飞生物科技有限公司，纯度≥98%；噻唑蓝检测试剂、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma 公司；Lipofectamine 2000 脂质体转染试剂购于美国Invitrogen 公司；Annexin Ⅴ/PI 细胞凋亡检测试剂盒购于上海翊圣生物科技有限公司；乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和肌酸激酶同工酶（CK-MB）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司；携带磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K）基因过表达的pcDNA 3.1-PI3K 质粒和作为对照的pcDNA 3.1 空载体质粒购自武汉华联科生物技术有限公司；RNA 提取试剂盒和反转录试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司；SYBR Green PCR Master Mix 检测试剂盒购自上海联迈生物工程有限公司；PI3K 抗体及二抗购自美国CST 公司；蛋白免疫印迹法（Western blot）所需试剂均购自碧云天生物技术研究所。

1.2 心肌细胞培养

心肌细胞H9c2 培养在含100 ml/L 胎牛血清的低糖DMEM 培养基的培养瓶中，放置在5% CO2、37℃培养箱中进行培养。待心肌细胞铺满培养瓶底部80%以上时，以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，加入2.5 g/L 的胰蛋白酶消化心肌细胞，进行传代培养。

1.3 实验分组和处理

心肌细胞接种到96 孔板中，待细胞生长融合至80%时，更换成不含血清的培养液，采用5%CO2、94% N2、1% O2条件下缺氧处理11 h，更换成正常含血清的细胞培养液及正常培养条件下复氧处理4 h，构建缺氧复氧心肌细胞损伤模型。在复氧处理4 h 后给予细胞6 μmol/L 的麦冬皂苷D（根据参考文献[8]和预实验结果选择的麦冬皂苷D 的实验浓度）处理24 h。实验分组：心肌细胞未行任何干预的对照组、缺氧复氧组(H/R组)、缺氧复氧+麦冬皂苷D组（H/R+OpD组）、缺氧复氧+麦冬皂苷D+pcDNA 空载体对照组（H/R+OpD+pcDNA组）和缺氧复氧+麦冬皂苷D+PI3K 过表达组（H/R+OpD+PI3K组）。心肌细胞 转染参照Lipofectamine 2 000 转染试剂说明书进行操作。各组心肌细胞处理24 h 后进行后续实验相关指标检测。

1.4 噻唑蓝法检测心肌细胞存活率

心肌细胞种植到96 孔板中，37℃继续培养48 h，更换成无血清的培养液对细胞进行同步化处理，按照上述1.3 法对细胞进行分组和处理，如文献[9]所述，分别向每孔细胞中添加浓度为5 mg/ml 的噻唑蓝溶液20 μl，于37℃继续孵育4 h，吸去上清液，再加入DMSO 150 μl，振荡10 min，待结晶物完全溶解后，使用全自动酶标仪检测490 nm 处各孔的光密度值（OD 值），按照公式计算各组心肌细胞的存活率。细胞存活率（%）=（实验组OD 值-空白对照组OD 值）/（对照组OD 值-空白对照组OD 值）×100%。

1.5 流式细胞术检测心肌细胞凋亡率

心肌细胞以5×105个/孔接种到6 孔板中，按照上述1.3 分组处理后，如文献[10]所述，加入胰蛋白酶消化并收集各组心肌细胞，加入结合缓冲液100 μl 重悬细胞，随后加入膜联蛋白V 5 μl，混匀，再加入碘化丙啶5 μl，混匀，避光孵育15 min，在1 h 内使用流式细胞仪检测各组心肌细胞凋亡率。

1.6 LDH、MDA 含量及SOD 活力检测

心肌细胞接种到24 孔板中，待心肌细胞贴壁生长后，按照1.3 方法分组并处理，如文献[11]所述，分别收集培养的上清液，以2 400 g 离心10 min，收集上清，黄嘌呤氧化法检测SOD 活力，硫代巴比妥酸比色法检测MDA 含量，二硝基肼显色法检测LDH 含量。参照LDH、MDA 和SOD 试剂盒使用说明书分别检测LDH 和MDA 的含量以及SOD 活力。

1.7 ELISA 检测CK-MB、TNF-α 和IL-1β 的含量

心肌细胞接种到24 孔板中，待心肌细胞贴壁生长后，按照1.3 方法分组并处理，如文献[12]所述，收集培养的上清液，采用ELISA 检测试剂盒CK-MB、TNF-α 和IL-1β的含量，严格按照ELISA检测试剂盒制造商说明书进行操作。

1.8 实时荧光定量PCR 检测PI3K mRNA 的表达量

心肌细胞接种到24 孔板中，待心肌细胞贴壁生长后，按照1.3 方法分组并处理，如文献[13]所述，收集各组心肌细胞，使用RNA 提取试剂盒提取待测心肌细胞的RNA，测定RNA A260 和A280，选取合格的RNA 进行反转录，使用反转录试剂盒对RNA 进行反转录，合成cDNA，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参，并以cDNA 为模板，行实时荧光定量PCR 检测，反应条件设为：95℃ 3 min，随后95℃ 30 s、退火58℃ 30 s、延伸72℃ 20 s，循环40 次。获取Ct 值，采用2-ΔΔCt法计算各组细胞中PI3K mRNA 的相对表达量。

1.9 Western blot 检测PI3K 蛋白表达

心肌细胞接种到24 孔板中，待心肌细胞贴壁生长后，按照1.3 方法分组并处理，如文献[14]所述，待测心肌细胞收集后，提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。加入上样缓冲液加热致蛋白变性，取40 μg蛋白样品上样，行SDS-PAGE 电泳，随后转膜至PVDF 膜上，于5%脱脂奶粉封阻2 h，以TBST 缓冲液洗膜3 次，加入1：800 稀释的PI3K 一抗，4℃过夜孵育，洗膜，再加入二抗（1:3 000 稀释），室温孵育2 h，显影后，采用凝胶成像系统扫描图像，以GAPDH 为内参，使用 Image J 软件分析蛋白条带，计算各组心肌细胞中PI3K 蛋白的相对表达水平。

1.10 统计学方法

用SPSS 21.0 分析数据。以上实验数据至少重复3 次，计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析多组间差异，采用SNK-q 检验分析组间两两差异，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心肌细胞中心肌损伤标志物CK-MB 的含量比较（图1）

图1 ELISA 检测各组心肌细胞中CK-MB 的释放量（n=3，）

ELISA 检测结果显示，与对照组[（9.14±0.88）U/L]相比，H/R组心肌细胞中CK-MB 的释放量[（19.35±2.13）U/L]明显升高（P<0.05）；与H/R组比较，H/R+OpD组中CK-MB 的释放量[（11.23±1.04）U/L] 明显减少（P<0.05）；与H/R+OpD组比较，H/R+OpD+PI3K组中CK-MB 的释放量[（17.94±1.81）U/L]明显增多（P<0.05），H/R+OpD+pcDNA组CK-MB的释放量[（10.89±1.03）U/L]无显著改变（P>0.05）。

2.2 各组心肌细胞存活率比较（图2）

图2 噻唑蓝法比较各组心肌细胞存活率（n=3，）

噻唑蓝法检测结果显示，与对照组[（100.00±10.21）%]相比，H/R组心肌细胞存活率[（56.26±5.57）%]明显降低（P<0.05）；与H/R组比较，H/R+OpD组细胞存活率[（90.65±8.72）%]明显升高（P<0.05）；与H/R+OpD组比较，H/R+OpD+PI3K组细胞存活率[（66.52±5.86）%]明显降低（P<0.05），H/R+OpD+pcDNA组细胞存活率[（89.49±8.90）%]无明显变化（P>0.05）。

2.3 各组心肌细胞凋亡率比较（图3）

图3 流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡情况（n=3，）

流式细胞术检测结果显示，与对照组[（3.75±0.23）%]相比，H/R组心肌细胞凋亡率[（16.76±1.68）%]明显升高（P<0.05）；与H/R组比较，H/R+OpD组细胞凋亡率[（5.27±0.55）%]明显降低（P<0.05）；与H/R+OpD组比较，H/R+OpD+PI3K组细胞凋亡率[（15.10±1.49）%]明显升高（P<0.05），H/R+OpD+pcDNA组细胞凋亡率[（5.62±0.53）%]无明显变化（P>0.05）。

2.4 各组LDH、MDA 含量及SOD 活力比较（表1）

表1 各组心肌细胞LDH、MDA 含量及SOD 活力比较（n=3，）

表1 各组心肌细胞LDH、MDA 含量及SOD 活力比较（n=3，）

注：对照组：心肌细胞未行任何干预组；H/R组：缺氧复氧组；H/R+OpD组：缺氧复氧+麦冬皂苷D组；H/R+OpD+pcDNA组：缺氧复氧+麦冬皂苷D+pcDNA 空载体对照组；H/R+OpD+PI3K组：缺氧复氧+麦冬皂苷D+PI3K 过表达组；LDH：乳酸脱氢酶；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；PI3K：磷脂酰肌醇-3 激酶。与对照组比*P<0.05；与H/R组比△P<0.05；与H/R+OpD组比▲P<0.05

试剂盒检测结果显示，与对照组相比，H/R组LDH 和MDA 含量明显升高（P均<0.05），SOD 活力明显降低（P<0.05）；与H/R组比较，H/R+OpD组LDH 和MDA 含量明显降低（P均<0.05），SOD活力明显升高（P<0.05）；与H/R+OpD组比较，H/R+OpD+PI3K组LDH 和MDA 含量明显升高（P均<0.05），SOD活力明显降低（P<0.05），而H/R+OpD+pcDNA组LDH、MDA 含量及SOD 活力无明显变化（P均>0.05）。

2.5 各组炎症因子TNF-α 和IL-1β 含量的比较（表2）

表2 ELISA 法比较各组心肌细胞上清中TNF-α 和IL-1β 含量（n=3，）

表2 ELISA 法比较各组心肌细胞上清中TNF-α 和IL-1β 含量（n=3，）

注：对照组：心肌细胞未行任何干预组；H/R组：缺氧复氧组；H/R+OpD组：缺氧复氧+麦冬皂苷D组；H/R+OpD+pcDNA组：缺氧复氧+麦冬皂苷D+pcDNA空载体对照组；H/R+OpD+PI3K组：缺氧复氧+麦冬皂苷D+PI3K过表达组；ELISA：酶联免疫吸附试验；TNF-α：肿瘤坏死因子α；IL-1β：白细胞介素1β；PI3K：磷脂酰肌醇-3 激酶。与对照组比*P<0.05；与H/R组比△P<0.05；与H/R+OpD组比▲P<0.05

ELISA 检测结果显示，与对照组相比，H/R组TNF-α 和IL-1β 含量明显升高（P均<0.05）；与H/R组比较，H/R+OpD组TNF-α 和IL-1β 含量明显降低（P均<0.05）；与H/R+OpD组比较，H/R+OpD+PI3K组TNF-α和IL-1β含量明显升高（P均<0.05），而H/R+OpD+pcDNA组TNF-α 和IL-1β 含量无明显变化（P均>0.05）。

2.6 各组心肌细胞中PI3K mRNA 和蛋白水平的比较（表3、图4）

图4 Western blot 检测各组心肌细胞中PI3K 蛋白表达的免疫印迹图

表3 各组心肌细胞中PI3K mRNA 和蛋白水平的比较（n=3，）

表3 各组心肌细胞中PI3K mRNA 和蛋白水平的比较（n=3，）

注：H/R组：缺氧复氧组；H/R+OpD组：缺氧复氧+麦冬皂苷D组；H/R+OpD+pcDNA组：缺氧复氧+麦冬皂苷D+pcDNA 空载体对照组；H/R+OpD+PI3K组：缺氧复氧+麦冬皂苷D+PI3K 过表达组；PI3K：磷脂酰肌醇-3 激酶。与对照组比*P<0.05；与H/R组比△P<0.05；与H/R+OpD组比▲P<0.05

实时荧光定量PCR 和Western blot 检测结果显示，与对照组相比，H/R组心肌细胞中PI3K mRNA和蛋白表达均明显升高（P均<0.05）；与H/R组比较，H/R+OpD组PI3K mRNA 和蛋白表达均明显降低（P均<0.05）；与H/R+OpD组比较，H/R+OpD+PI3K组PI3K mRNA 和蛋白表达均明显升高（P均<0.05），而H/R+OpD+pcDNA组PI3K mRNA 和蛋白表达无明显变化（P均>0.05）。

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是影响缺血性心脏病治疗效果的关键因素之一。因此，有效缓解心肌缺血再灌注损伤对于提高心肌缺血患者治疗效果至关重要。为探究麦冬皂苷D 对缺血再灌注损伤的影响潜在机制，本实验通过缺氧复氧处理心肌细胞模拟心肌缺血再灌注损伤，结果显示，缺氧复氧后心肌细胞损伤标志物CK-MB 的含量明显升高，细胞存活率降低，凋亡率升高，提示缺氧复氧可致心肌细胞损伤。MDA 是脂质过氧化的产物之一，其可加剧细胞膜的损伤，是反映细胞氧化应激损伤的重要指标。LDH 是一类胞内酶，作为组织损伤的标志物之一，其外泄量在一定程度上反映细胞膜通透性损伤的程度。SOD 是机体内重要的抗氧化酶，其活性越高细胞抗氧化能力越强。有研究显示，缺血再灌注损伤的心肌中大量氧自由基累积，导致正常的脂质发生过氧化产生过量的MDA，增加心肌细胞膜的通透性，诱发LDH 等物质大量外泄，最终导致心肌细胞凋亡[15-16]。本实验缺氧复氧心肌细胞中LDH 和MDA 含量明显升高，SOD 活力显著下降，提示缺氧复氧能够引发心肌细胞氧化应激损伤。而麦冬皂苷D 能够降低LDH 和MDA 的含量，提高SOD 的活力，表明麦冬皂苷D 对缺氧复氧诱发的心肌细胞氧化应激损伤起保护作用。大量研究显示，炎症介质如TNF-α、IL-1β、IL-1 和IL-6 等的大量释放，引发心肌的炎症反应，参与心肌细胞凋亡进而影响心肌缺血再灌注的发病过程[17]。本实验结果显示，麦冬皂苷D 能够下调缺氧复氧诱导的心肌细胞中炎症因子TNF-α 和IL-1β 的含量，对心肌细胞起到保护作用。

PI3K 是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性，在各种细胞中广泛存在。PI3K受外界信号刺激后，通过一系列级联反应引发蛋白激酶B（Akt）的激活，实现信号通路PI3K/Akt的激活，参与细胞增殖、凋亡、分化等多种生物学过程[18-19]。目前研究显示，PI3K 含量与心肌缺血再灌注损伤程度及患者预后密切相关，PI3K/Akt 信号通路的激活能够促进心肌缺血再灌注损伤的进展[20-22]。本实验结果显示，缺氧复氧的心肌细胞中PI3K 含量明显升高，这与以往研究相符。麦冬皂苷D 能够逆转缺氧复氧引发的心肌细胞中PI3K 的表达升高，换言之，麦冬皂苷D 干预降低了PI3K 的表达。这些研究结果提示麦冬皂苷D 对缺氧复氧心肌细胞损伤的保护作用可能与抑制PI3K 的表达有关。因此本实验通过转染上调麦冬皂苷D 干预缺氧复氧的心肌细胞中PI3K 的表达，结果发现，上调PI3K 后心肌细胞损伤标志物CK-MB的含量升高，心肌细胞存活率降低，凋亡率升高，LDH 和MDA 含量上调，SOD 活力降低，IL-1 和IL-6 分泌增多。这些结果表明上调PI3K 能够部分抵消麦冬皂苷D 对缺氧复氧心肌细胞的保护作用，验证了麦冬皂苷D 能够通过调控PI3K 对缺氧复氧心肌细胞损伤起保护作用。

综上，本实验结果显示麦冬皂苷D 能够保护缺氧复氧心肌细胞，其作用机制可能与抑制PI3K 的表达有关。但麦冬皂苷D 是否通过调控PI3K/Akt 信号通路参与缺氧复氧心肌细胞损伤，或是否存在其他相关机制仍需后续实验进行深入探究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突