水铁矿驱动Feammox处理污泥消化液中的氨氮

梁松 杨亚飞 张耀斌

摘 要：异化铁还原耦合厌氧氧化（Feammox）是自然环境中普遍存在的氨氮去除途径，但该过程在污水处理领域的研究及应用还比较少。以含氨氮的污泥消化液为对象，研究其在厌氧条件下由水铁矿驱动Feammox进行脱氮的效果。结果表明：经过48 d厌氧处理后，NH+4-N去除率和总氮去除率分别为72.4%和57.5%，而未投加水铁矿的对照组中NH+4-N去除率和总氮去除率分别为7.6%和2.5%;在投加水铁矿的反应器内检测到Fe（Ⅱ）的持续产生;以同位素标记的15NH+4-N进料，在投加水铁矿的反应器顶空中检出30N2，证明了Feammox的发生;实时定量PCR（qPCR）结果显示，Feammox功能微生物Acidimicrobiaceae A6菌表达活跃。高通量测序表明，在投加水铁矿的反应器内富集了多种铁还原菌;同时，向反应器内投加水铁矿和腐殖质后，NH+4-N去除率达88.35%，总氮去除率达73.75%，对反应器内铁氧化物组成和形态分析发现，腐殖质减弱了铁氧化物钝化速度，有利于水铁矿保持活性并持续参与Feammox脱氮。

关键词：含氮废水;生物脱氮;异化铁还原;铁氨氧化

中图分类号：X703.1   文献标志码：A   文章编号：2096-6717（2022）01-0168-09

收稿日期：2021-05-04

基金项目：国家自然科学基金（21777016）

作者简介：梁松（1995- ），女，主要从事厌氧水处理研究，E-mail：elle_liang@163.com。

张耀斌（通信作者），男，教授，博士生导师，E-mail：zhangyb@dlut.edu.cn。

Abstract： Dissimilar iron reduction coupled with anaerobic oxidation （Feammox） is a common pathway to oxidize ammonia nitrogen in natural environment， which however has been rarely reported in sewage treatment. In this study， the sludge digester liquor was used as the NH+4-N source to study the NH+4-N removal during Feammox driven by adding ferrihydrite under anaerobic conditions. The results showed that after 48 days of anaerobic incubation， the NH+4-N removal efficiency and total nitrogen removal efficiency were 72.4% and 57.5%， respectively， while the NH+4-N removal efficiency and total nitrogen removal efficiency in the reactor without adding ferrihydrite were 7.6% and 2.5%， respectively. The continuous production of Fe（Ⅱ） was detected in the ferrihydrite-added reactor. After feeding with isotope-labeled 15NH+4-N as the NH+4-N source， 30N2 was detected in the headspace of the ferrihydrite-added reactor， which proved the occurrence of Feammox. Real-time quantitative PCR（qPCR） results showed that Acidimicrobiaceae A6 expressed actively. High-throughput 16S rDNA showed that a variety of iron-reducing bacteria were significantly enriched. After simultaneously adding ferrihydrite and humus into the reactor， the removal efficiency of NH+4-N further increased to 88.35%， and the removal efficiency of total nitrogen reached 73.75%. The analysis of the composition and morphology of iron oxides added in the reactors showed that humus weakened the passivation rate of iron oxides， which was beneficial for ferrihydrite to maintain activity and continue to participate in Feammox.

Keywords：nitrogen containing wastewater; biological nitrogen removal; dissimilated iron reduction; Feammox

硝化反硝化是常用的廢水生物脱氮工艺，但硝化反应需要曝气，反硝化反应在处理低C/N废水时需要外加碳源[1]。厌氧氨氧化（Anammox）是以NO-2为电子受体将NH+4氧化的生物脱氮工艺，能耗低且污泥产量少，但Anammox的功能菌增殖缓慢且对环境敏感[2]。上述不足使两者在工程应用中均存在不同的局限性。异化铁还原耦合厌氧氨氧化（Feammox），是指微生物以Fe（Ⅲ）为最终电子受体将NH+4氧化成N2、NO-2或NO-3[3]的过程，是一种广泛存在于自然环境中的脱氮途径。Feammox过程无需曝气和专门的Anammox微生物，是一种区别于硝化反硝化和厌氧氨氧化的新型生物脱氮方式。

目前，有关Feammox的研究主要集中于自然环境中的物质迁移转化和元素循环[3-6]。但在废水脱氮方面，由于Feammox发现较晚，目前的少量报道主要以人工配制废水为主[7-8]，且缺乏15N标记同位素等手段进行证实。另一方面，Feammox与异化铁还原密切相关[9]。据报道[10]，腐殖质结构上具有的羟基/醌基可用作电子穿梭体，提高异化铁还原效率。但腐殖质是否可以用于加快Feammox的报道较少。

笔者将稀释后的污泥消化液作为处理对象，向厌氧反应器内投加水铁矿，尝试驱动Feammox过程并探究其对氮去除效果的影响;利用同位素标记、微生物群落分析等方法研究脱氮与Feammox的相关性;投加腐殖质探究其对Feammox脱氮的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 引种污泥及其驯化

引种污泥取自大连市某污泥处理厂的厌氧消化污泥（VS 35±0.2 g/L）。为消耗引种污泥中所含的有机物，避免其与废水中的NH+4竞争投加到反应器中的水铁矿，以及避免引种污泥中的蛋白质在分解过程中释放出的氨氮造成实验反应器中NH+4-N浓度产生较大波动，实验前在上流式厌氧污泥床（UASB）中对引种污泥进行连续流进水厌氧驯化，直至反应器的出水NH+4-N浓度不再变化。

1.1.2 水铁矿合成

使用的水铁矿根据Cornell等[11]的方法合成，即在磁力搅拌条件下向FeCl3·6H2O溶液中逐滴加入1 mol/L NaOH溶液，调节pH值为7.0～7.6，得到褐色悬浮状水铁矿后静置并吸去上清液，用去离子水重复洗涤离心（8 000 r/min，10 min）3次，去除多余的去离子水后冷冻干燥，获得实验所用水铁矿。

1.1.3 污泥消化液

实验所用的污泥消化液同样取自大连市某污泥处理厂，稀释20倍后NH+4-N浓度为91.03 mg/L，TCOD浓度为71.23 mg/L，pH值为6.8～7.2。主要初始指标如表1所示。

1.1.4 腐殖质

实验所用腐殖质为阿拉丁试剂（上海）有限公司所生产的腐植酸，主要成分为黄腐酸，CAS为1415-93-6。

1.2 实验方案及测试方法

1.2.1 实验设置

实验开始前，将无菌缺氧的去离子水与经过驯化后的引种污泥按照体积比3∶1的比例充分混合，在黑暗中于25 ℃预培养3 d，以去除背景氮氧化物，去除上清液后的污泥用作实验接种污泥，主要初始指标如表2所示。向100 mL血清瓶中加入7 mL已去除上清液的接种污泥和70 mL稀释后的污泥消化液。设置实验方法（每组9个血清瓶）：1）未投加水铁矿的对照组;2）投加水铁矿的水铁矿组;3）投加水铁矿和腐殖质的腐殖质组。用丁基橡胶隔片密封血清瓶，并用铝盖压盖后用超高纯氩气冲洗血清瓶以排出空气，然后将其置于充满氩气的厌氧手套箱中，该手套箱放置于恒温房中。

每间隔2 d从血清瓶中进行破坏性采样，每个血清瓶采样2次后丢弃。取样前，剧烈摇晃血清瓶以混匀样品，取样在充满氩气的厌氧手套箱中操作。

1.2.2 15N同位素标记实验

同位素标记培养所使用的培养基组分为：MgCl2·6H2O（0.4 g/L）、CaCl2·H2O（0.1 g/L）、15NH4Cl（0.1 g/L）和KH2PO4（0.6 g/L）、1 mL/L维生素溶液、1 mL/L微量元素溶液、30 mmol/L碳酸氢盐缓冲液和2 mmol/L乙酸盐[12]。所有实验的接种污泥处理方法和实验方法设置全部一致。同位素标记培养基在厌氧手套箱中培养30 d后，使用配有质谱分析仪的气相色谱仪（GC/MS， QP2020）检测厌氧反应器顶空气体中30N2的生成（色谱柱类型为SH-RXI-5silMS，气体手动进样，进样口温度280 ℃，质谱扫描范围12～32 m/z，全扫描）。顶空气体中的N2体积通过带有热导检测器（TCD）的气相色谱仪（Tianmei， GC-7900P/TCD， 中国）进行测定。

1.2.3 分析仪器和测试方法

采用纳氏试剂法测定NH+4-N浓度，N-（1-萘基）-乙二胺法测定NO-2-N，紫外分光光度法测定NO-3-N，过硫酸钾分光光度法测定总氮[13]。反应器内铁氧化物的晶体形态采用X射线衍射（XRD）鉴定。XRD衍射仪（SmartLab 9 kW，日本）配备有Cu-Ka辐射，电压为45 kV，电流为200 mA。根据Ding等[9]的方法测定反应器中的Fe（Ⅱ）和Fe（Ⅲ），即在室温下用5 mL 0.5 mol/L的HCl提取1 mL泥水混合物2 h，然后以8 000 r/min离心5 min，通过0.22 mm过滤器过滤后用邻菲罗啉分光光度法测定上清液的Fe（Ⅱ）含量。

采用分步提取法对反应器内不同铁氧化物进行提取并对其各自所占比例进行计算[14-16]。

第48天的对照组和水铁矿组反应器内的污泥样品委托上海美吉生物公司通过高通量16S rDNA测序进行微生物群落分析：根据 E.Z.N.A. soil DNA kit （Omega Bio-tek， Norcross， GA， U.S.）说明书进行微生物群落总DNA抽提，使用338F （5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3）和806R （5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增之后的产物经过回收纯化和检测定量后利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平台进行测序。

同时委托上海美吉生物公司进行基于RNA的实时定量PCR分析（qPCR），用于进一步确定某些功能性基因的绝对数量和活性[17]。使用引物组1055f/1392r对16S rRNA基因进行总细菌定量表示。使用引物组Amx368f/Amx820r鉴定量化Anammox功能菌，Feammox功能微生物Geobacteraceae和Acidimicrobiaceae A6细菌分别使用引物组Geo494F/Geo825R和acm342f/439r进行鉴定量化[18-19]。具体的引物信息如表3所示。

2 试验结果与讨论

2.1 投加水铁矿对氨氮去除的影响

如图1（a）所示，经过48 d处理后，水铁矿组中NH+4-N的浓度从初始的91.03 mg/L降至25.11 mg/L，而未投加水铁矿或离子态Fe（Ⅲ）的对照组中NH+4-N浓度只略微降低至86.62 mg/L。即，水铁矿组中NH+4-N的去除率约为72.4%，而对照中的去除率仅为7.6%。在热力学上，有机物比NH+4更具有优势成为Fe（Ⅲ）还原的电子供体[20]。可以看出，在反应前期NH+4-N浓度下降并不明显。这是因为污泥消化液的TCOD为71.23 mg/L，其中的少量有机物会与氨氮竞争电子受体水铁矿;随着有機物被消耗，NH+4才更多地被用作异化Fe（Ⅲ）还原，因此，图1（a）中投加水铁矿组的NH+4-N浓度下降存在滞后。另外，相关功能微生物的富集过程可能也是导致滞后的原因之一。

为考察反应器内是否生成了Feammox产物NO-3和NO-2，在实验过程中不定期测定了反应器内NO-3-N和NO-2-N含量，结果如图1（b）、（c）所示。在反应器中检测到NO-3和NO-2，且水铁矿组中的浓度总是高于对照组（图1（b）、（c）），这与图1（a）中NH+4-N浓度的变化差异是一致的，表明投加水铁矿促进了NH+4的转化。可以看到，反应器中NO-3和NO-2浓度均较低，这是因为N2是Feammox过程中的主要转化产物，占Feammox总产物的67%～78%[9]，所以，NO-2和NO-3的产量较小;同时，厌氧条件下的NO-2和NO-3可被Fe（Ⅱ）分别以化学反硝化以及硝酸盐依赖型铁氧化（NO-3 dependent Fe（Ⅱ） oxidation，NDFO）的方式被还原[21]，因此，NO-2和NO-3难以大量存在，同时，这两种物质作为中间物质，含量波动变化，与反应时间无明显线性关系。需要指出的是，对照组中所检测到的NO-x以及少量氨氮损失（图1（a））也来自Feammox。原因是对照组中的污泥也含有0.047%的背景Fe（Ⅲ），这大部分来自污泥调理过程中的铁絮凝剂。

为了进一步研究投加水铁矿对氮去除的影响，对实验前后的总氮进行测定（图1（d））。结果表明，水铁矿组的总氮去除率为57.5%，而对照组仅为2.5%，表明向厌氧反应器中投加水铁矿可以显著提高氮的去除率。

2.2 Fe（Ⅱ）浓度变化

Fe（Ⅱ）作为Feammox的水铁矿还原产物，可以间接反映异化铁还原和脱氮的程度。图2描述了实验过程中Fe（Ⅱ）浓度的变化。水铁矿组中，Fe（Ⅱ）浓度从388.58 mg/L逐渐增加至1 917.27 mg/L，最后一天降至1 138.33 mg/L。Fe（Ⅱ）浓度的增加与图1（a）中水铁矿组中NH+4-N的去除结果相呼应。而对照组中Fe（Ⅱ）浓度基本保持在400 mg/L左右，这是接种污泥中背景Fe（Ⅲ）参与异化铁还原的结果，但接种污泥在实验前经过驯化，其中的背景Fe（Ⅲ）被自身所含的有机物消耗，导致其含量不高且多难以被微生物利用，因此，对照组中的Fe（Ⅱ）含量基本不变。水铁矿组的Fe（Ⅱ）浓度上升与NH+4-N浓度下降，表明反应器中NH+4转化率的提高与异化Fe（Ⅲ）还原有关，即投加水铁矿驱动了Feammox过程进行脱氮。

另外，第42天水铁矿组中Fe（Ⅱ）浓度急剧下降。Boland等[22]指出，在水溶液态Fe（Ⅱ）的存在下，水铁矿可以化学转化为晶型更为稳定的铁矿物质。从实验结束时水铁矿组污泥冷冻干燥后的XRD图谱（图3）可以看出，在加了水铁矿的反应器中形成了磁铁矿。Yang等[23]也在实验终止后投加有水铁矿的反应器污泥中检测到磁铁矿（Fe3O4）和纤铁矿（FeOOH）。也就是说，反应器内的水铁矿转化成了微生物难以利用的磁铁矿，可被利用还原的Fe（Ⅲ）越来越少，Fe（Ⅱ）生成量越来越少，同时，又存在Fe（Ⅱ）被NO-x氧化的过程，Fe（Ⅱ）生成量少于消耗量，导致了Fe（Ⅱ）浓度的下降。

2.3 同位素标记结果分析

为了进一步证实Feammox过程的脱氮作用，采用N-15标记的NH+4和水铁矿在相同的接种污泥中混合培养。该培养全程在厌氧手套箱中进行，严格厌氧消除有氧硝化的可能性。在厌氧条件下，Feammox可以直接生成30N2（3Fe（OH）3+ 5H+ + 15NH+4→3Fe2+ + 9H2O + 0.530N2），或者利用Feammox生成的15NO-3和15NO-2通过Anammox或反硝化生成30N2[24]。从表4可知，所有潜在的30N2生成途径都必须以Feammox发生为前提。因此，如在反应器的顶空气中检测到30N2，可以证明厌氧反应器中发生Feammox。

经检测，对照组中30N2的总产量约为0.013 μmol，而水铁矿组总产量约为65.69 μmol，是未投加水铁矿的对照组总产量的5 000倍以上（图4）。在水铁矿组反应器顶空气体中检测到30N2以及两组30N2生成量的巨大差距证明了向厌氧反应器中投加Fe（Ⅲ）驱动了Feammox过程发生。同时，在后续的微生物群落分析中Anammox菌未被检测到，即进一步排除了反应器内的NH+4通过Anammox途径被去除的可能。

此外，29N2在水铁矿组中也大量累积，表4中显示了几种潜在的29N2生成途径，包括通过Feammox直接生成，或者利用Feammox生成的15NO-x与背景14NH+4或14NO-x通过Anammox或反硝化生成29N2。Yang等[24]利用同位素标记法在热带土壤中证明Feammox时也发现了添加Fe（Ⅲ）和15NH+4后，除30N2外，29N2的产量也显著提高，认为添加Fe（Ⅲ）后对29N2产生的刺激表明，无论29N2的生成机制是什么，Feammox在NH+4的厌氧氧化中有重要作用。本研究中投加水铁矿后29N2产量的激增也说明Feammox在厌氧NH+4氧化中发挥了重要作用。

2.4 微生物群落分析

到目前为止，Feammox的功能性微生物尚未被完全阐明，大多数研究认为铁还原菌是Feammox的功能微生物[12， 25]。在本研究中，水铁矿组中的铁还原菌被富集。对比对照组和水铁矿组，在属水平，Geobacter在水铁矿组中的相对丰度为0.54%，而在对照组中仅为0.003 6%，相差约150倍。

此外，Huang等[19]在河岸湿地中发现了另一种在Feammox中起重要作用的微生物（Acidimicrobiaceae A6菌），其被确认为是Feammox的功能微生物。在本研究中，尽管在16S rDNA高通量测序中未检测到Acidimicrobiaceae A6细菌，但基于RNA的实时定量PCR分析（qPCR）结果显示，在水铁矿组和对照组中Acidimicrobiaceae A6细菌的拷贝数分别为4.15×107和4.90×106，这一差距表明，作为Feammox功能微生物的Acidimicrobiaceae A6细菌在投加Fe（Ⅲ）的厌氧反应器中表达得更为活跃。

特别地，16S rDNA高通量测序结果和qPCR中都未检测到Anammox菌或Anammox基因，进一步证明了氨氮的去除并非由Anammox导致。

2.5 投加腐殖质对脱氮效果的影响

异化铁还原过程中，微生物将电子传递至胞外不溶性铁氧化物，是其呼吸代谢的制约性步骤。同时，反应过程中生成的Fe（Ⅱ）不断沉积在铁氧化物表面并与其进行电子交换，导致次生矿物生成，铁氧化物晶型不断向更稳定状态转化，使微生物难以利用。上述原因导致了异化铁还原的速率逐步降低。一般说来，小分子有机物可作为有机碳源被微生物吸收用于生长，而腐殖质为大分子有机物，难以进入细胞内部为微生物提供生长所需碳源。据报道[10]，腐殖质以电子穿梭体的作用存在于异化铁还原过程中。为探究腐殖质在Feammox过程中的作用，在投加水铁矿的同时向反应器内投加腐殖质。

经过48 d厌氧培养，投加有腐殖质的反应器内NH+4-N浓度由最初的91.03 mg/L降至10.16 mg/L，NH+4-N去除率和总氮去除率分别为88.35%和73.75%，对比只投加水铁矿的反应器的72.4%和57.54%，分别提高了15.95%和16.21%，说明向反应器内投加腐殖质后进一步促进了Feammox厌氧脱氮。

在厌氧培养48 d后，水铁矿组和腐殖质组反应器内Fe（Ⅱ）浓度最终分别为1 138.33、1 839.18 mg/L，相应的Fe（Ⅱ）生成率分别为23.72、38.32 mg/（L·d），反应器内Fe（Ⅱ）的生成速率提高了近一倍。根据第48天两组反应器内二价铁浓度对铁还原率进行核算，结果如图5所示，水铁矿组和腐殖质组反应器内的铁还原率分别为46.18%和89.36%，鐵还原率提高了40%以上。结果表明，投加腐殖质后，通过促进异化铁还原过程提高了Feammox的反应速率。

图6为单独投加水铁矿和同时投加水铁矿和腐殖质组内样品的扫描电子显微镜（SEM）图像，可以看到，未投加腐殖质的反应器内块状磁铁矿颗粒更清晰，体积更大，数量较多，分布更密集;而投加了腐殖质的反应器内混合物的形态更为蓬松，颗粒状晶型不明显，数量少，分布散，体积也更小。结果表明，向反应器内投加腐殖质可以减缓反应器内结构松散的铁氧化物向结构密实的高结晶态铁氧化物的转化进程。

X射线光电子能谱（XPS）分峰拟合结果如图7所示，水铁矿组样品的Fe 2p图谱在723.1、710.61 eV处出现两个峰，分别对应了Fe3O4的Fe 2p1/2和Fe 2p3/2自旋轨道跃迁[26]，说明反应器内生成了高结晶态的磁铁矿，而腐殖质组样品的Fe 2p图谱在724.6、710.8 eV处出现两个峰，对应了Fe2O3的存在，该结果与SEM结果吻合，表明投加腐殖质可减慢水铁矿的晶型转变速度。

此外，对比两组样品的Fe 2p扫描图谱可以发现，水铁矿组样品的图谱更为平滑，而腐殖质组样品的图谱上有许多噪音信号，说明该样品表面的含铁量较少，而腐殖质的投加并不会改变样品表面的含铁量，原因可能是腐殖质覆盖在铁氧化物的表面并与其结合，这种作用会加速电子传递，进而提高反应速率。

对反应结束后的水铁矿组和腐殖质组内不同铁氧化物进行提取，确定其各自占总量的比例，结果如图8所示。两组样品中主要以易还原的羟基氧化铁（水铁矿和纤铁矿）和结晶态的铁氧化物形式存在，水铁矿组和腐殖质组内易被还原态的铁氧化物占比分别为41.92%和52.44%，结晶态的铁氧化物占比分别为55.21%和41.63%。可以看到，在投加了腐殖质的反应器内易被还原形态的铁氧化物所占比例最高，而未投加腐殖质的反应器内高结晶态铁氧化物含量最高，表明腐殖质在一定程度上可以阻止部分铁氧化物向晶型更为稳定的铁矿物转化。

3 结论

向污泥消化液中投加水铁矿驱动厌氧反应器中Feammox过程发生，研究投加Fe（Ⅲ）对氮去除效果的影响，得到以下主要结论：

1）48 d后，水铁矿组的NH+4-N去除率为72.4%，比对照组提高了64.8%，总氮去除率提高了50%以上;投加腐殖质后，NH+4-N去除率为88.35%，总氮去除率为73.75%，对比水铁矿组分别提高了15.95%和16.25%，说明投加Fe（Ⅲ）后提高了厌氧反应器中氮的去除率，腐殖质的投加进一步促进了NH+4的转化。

2）使用同位素标记的15NH+4进料，在投加了Fe（Ⅲ）的反应器顶空气体中检出30N2，证明在厌氧反应器中发生了Feammox。

3）微生物群落分析结果表明，投加水铁矿后在反应器内富集了Geobacter等多种铁还原菌;qPCR结果表明，投加水铁矿的反应器内Feammox功能微生物Acidimicrobiaceae A6菌表达活跃，说明反应器内的氮去除与Feammox有关。

4）反应器内的铁氧化物组成及形态分析表明，腐殖质除了以电子穿梭体进行作用外，还可通过减缓铁氧化物钝化，增强异化铁还原而提高Feammox效率。

利用水铁矿驱动了Feammox脱氮，而腐殖质进一步促进了该过程，氮去除率进一步提高。需要指出的是，Feammox过程中氨氮去除需要较长反应时间，这可能与Feammox的自养方式有关，也与异化铁还原的胞外电子传递相关。可以在微生物富集、强化，以及提高胞外电子传递等方面进一步开展研究。

区别于传统生物脱氮方式，该方法可在厌氧消化器内实现脱氨氮，前提是需要Fe（Ⅲ）的持续投加。连续投加Fe（Ⅲ）看似不易，但对于富含Fe（Ⅲ）的芬顿污泥，可将其用作三价铁源。尤其对具备较长处理时间条件的垃圾填埋场，Feammox可以作为一种有较好应用前景的生物脱氮技术。参考文献：

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（編辑 黄廷）