抗酸染色和荧光定量聚合酶链反应检测对结核病的诊断价值

黎钰凤

广东省罗定市人民医院病理科 （广东罗定 527200）

肺结核主要指由结核分枝杆菌感染所导致的呼吸系统传染疾病，病灶可出现在肺组织、气管、支气管及胸膜部位[1]。该病主要通过呼吸道飞沫形式传播，在谈话、咳嗽、打喷嚏时，患者可将含有结核分枝杆菌的微滴由呼吸道播散至空气中，并且病菌能够在空气内停留数小时，当被其他人吸入后即可引发感染。在我国，肺结核属于乙类法定报告传染病[2]。其会对肺组织造成破坏，从而影响肺功能，病灶广泛破坏肺组织会导致肺功能丧失，进而出现缺氧及二氧化碳潴留等情况，伴随病灶的修复亦会出现肺纤维化，若合并胸膜炎，还会出现胸膜粘连。此外，肺结核还会对机体营养代谢产生影响，从而对机体其他器官功能造成损伤。因此，早期对疾病进行有效诊断并及时采取措施干预，对控制疾病、改善疾病预后具有重要意义。目前，临床诊断肺结核的方式包含临床表现、X 线及实验室检查等，其中，抗酸染色属于常用的实验室诊断方式[3]。伴随医疗技术水平的不断发展，荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测被应用于结核病的诊断中。但目前临床关于上述两种检测方式诊断效果比较的研究较少，一定程度上限制了检测方式的合理选择。基于此，本研究对100例疑似肺结核患者痰液样本分别开展抗酸染色与荧光定量PCR 检测，以比较两者的诊断价值，为临床合理选择诊断方式提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2019年11月至2020年11月在我院开展检查的100例疑似肺结核患者（排除已明确为肺结核且已开展相应治疗、妊娠期、哺乳期或患有免疫系统疾病的患者）的痰液样本作为研究样本。100例疑似患者中，男57例，女43例；年龄25～75岁，平均（51.32±4.95）岁；病程3～13周，平均（10.12±1.01）周；体质量46～90 kg，平均（65.69±3.87）kg。

1.2 方法

1.2.1 检测仪器及试剂

JK10153型抗酸染液（采购自上海劲马生物科技有限公司）、FQD-16A 型实时荧光定量PCR 分析仪（采购自杭州博日科技股份有限公司）、荧光定量PCR 检测试剂盒（采购自上海莼试生物技术有限公司）。

1.2.2 检测方法

抗酸染色检测：选择痰液样本内0.05 ml 脓样、干酪样或疑似部分，将其均匀涂抹在载玻片上，使其形成10 mm×20 mm 的卵圆形痰膜，在自然环境下干燥，并放置在紫外线灯下进行1 h 照射杀菌；之后加热固定，并实施抗酸染色，染色结束后放置在医学显微镜下进行观察。

荧光定量PCR 检测：将4%氢氧化钠溶液添加在痰液样本内，要求氢氧化钠含量为痰液样本含量的4倍，充分混合均匀，在室温下静置0.5～1.0 h，促使其液化；采集0.5 ml 液化后痰液样本，并放置在1.5 ml 离心管内，添加4%氢氧化钠溶液，静置10 min，之后以13 000 rpm 的转速离心10 min，去掉上层清液，并在下层沉淀物内添加1 ml 无菌0.9%氯化钠注射液，充分振荡并混合均匀，再次以13 000 rpm 的转速离心10 min，重复洗涤1次，去掉上层清液，在下层沉淀物内添加50 μl 核酸提取物，充分振荡均匀，并放置在100 ℃环境中进行10 min 恒温处理，之后以12 000 rpm 的转速离心10 min，去除上层清液后备用；分别选择20 μl 阴性对照品及阳性对照品，并分别向其中添加2 μl 核酸提取物，充分混合均匀后置于100 ℃环境中恒温处理10 min，之后以12 000 rpm 的转速离心10 min，去除上层清液备用；配制试剂、加样，进行PCR扩增和荧光检测。

1.3 观察指标

（1）分析全部患者的结核分枝杆菌培养结果：对全部痰液样本开展结核分枝杆菌培养试验，将发现结核分枝杆菌作为判断肺结核阳性的主要标准。（2）分析抗酸染色和荧光定量PCR 检测的检出情况：抗酸染色检测结果的判断标准为在300个视野内观察到1条或1条以上抗酸杆菌即为阳性，未观察到抗酸杆菌则判断为阴性[4]；荧光定量PCR 检测结果的判断标准为检测样本CT 值≤38.0提示为阳性，检测样本CT 值＞38.0提示为实验灰区，检测样本CT 值为0提示为阴性[5]。（3）比较两种检测方式的阳性检出率。（4）比较两种检测方式的诊断效能（灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及准确度）：灵敏度=真阳例数/（真阳例数+假阴例数）×100%，特异度=真阴例数/（真阴例数+假阳例数）×100%，阴性预测值=真阴例数/（真阴例数+假阴例数）×100%，阳性预测值=真阳例数/（真阳例数+假阳例数）×100%，准确度= （真阳例数+真阴例数）/总例数×100%。

1.4 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计数资料以率表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 全部患者的结核分枝杆菌培养结果

结核分枝杆菌培养结果显示，100例疑似肺结核患者中，90例（90.00%）为肺结核阳性，10例（10.00%）为肺结核阴性。

2.2 抗酸染色和荧光定量PCR 检测的检出情况

抗酸染色检测结果显示，肺结核阳性58例、阴性42例；荧光定量PCR 检测结果显示，肺结核阳性86例、阴性14例，见表1～2。

表1 抗酸染色检测结果（例）

表2 荧光定量PCR 检测结果（例）

2.3 两种检测方式的阳性检出率比较

抗酸染色检测的阳性检出率低于荧光定量PCR检测，差异有统计学有意义（P＜0.05），见表3。

表3 两种检测方式的阳性检出率比较[例（%），100例]

2.4 两种检测方式的诊断效能比较

两种检测方式的特异度及阳性预测值比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；抗酸染色检测诊断的灵敏度、阴性预测值及准确度均低于荧光定量PCR 检测，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 两种检测方式的诊断效能比较（%）

3 讨论

结核病主要指由结核分枝杆菌所导致的慢性传染疾病，会侵犯多种脏器，以肺结核最为常见。机体在感染结核分枝杆菌后并不一定发病，当细胞介导的变态反应升高或免疫功能下降时才会导致临床发病。若能够及时诊断，并采取合理治疗，通常能够获得临床痊愈。因此，早期准确诊断尤为重要。涂片抗酸染色检查是临床诊断结核病的常用方式，但是在长期应用过程中发现，由于受到人为、试剂及样本等因素影响，导致阳性检出率较低，一定程度上限制了结核病诊断水平的提升[6]。因此，探寻有效的诊断方式成为临床研究的重点。

荧光定量PCR 为一种在DNA 扩增反应内，以荧光化学物质检测每次PCR 循环后产物总量的方法[7]。张帆[8]的研究结果显示，荧光定量PCR 检测对结核分枝杆菌DNA 的阳性检出率为95.00%，其认为在肺结核诊断中开展上述检测能够提升诊断效果。本研究结果显示，荧光定量PCR 检测的阳性检出高于抗酸染色检测（P＜0.05），与上述研究结果相似。抗酸染色检测能够结合HE 组织学形态进行定位观察，且检测费用较低、操作方便[9]。但无论采取何种抗酸染色形式，灵敏度及特异度均较低，一般样本内包含杆菌量需达到10 000个/ml 时才会提示为阳性结果，同时无法有效区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，还易受到观察者主观因素的影响，导致出现误诊或漏诊情况[10]。在荧光定量PCR 检测中，在PCR 反应体系内添加了荧光基团，通过荧光信号积累对整个PCR 进程进行密切监测，最终利用标准曲线对未知模板实施定量分析。荧光定量PCR 是在PCR 灵敏度及特异度高的基础上，将PCR 探针和DNA 技术进行杂交集合，进而探测PCR进程中的荧光改变情况，具有操作简便、灵敏度高、可定量及污染少等优点[11]。荧光定量PCR 技术CT值同DNA 数量的对数值呈线性关系，当信号升高至荧光阈值时，CT 值将会被记录，依据CT 值能够计算样本内结核分枝杆菌DNA 的水平，初始拷贝数越多则CT 值越低[12]。在开展荧光定量PCR 技术检测时，检测过程全封闭，无需扩增后开盖处理，能够有效避免假阳性情况的发生，同时，该检测方式灵敏快速，尤其适用于生长缓慢的结核分枝杆菌的检测。本研究结果显示，以结核分枝杆菌培养结果为金标准，荧光定量PCR 检测诊断肺结核的灵敏度、阴性预测值、准确度均高于抗酸染色（P＜0.05)。

综上所述，荧光定量PCR 检测能够提升对肺结核的阳性检出率及诊断效能，为疾病早期诊断及开展个性化治疗提供参考依据。